Name: Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Apprenez à cultiver des neurones sympathiques à partir de ganglions cervicaux supérieurs de rats périnataux et à induire leur croissance dendritique avec BMP-7 ou Matrigel. Cette méthode permet d'étudier la morphogenèse neuronale.

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<li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15, 597-605 (1995).</li>
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<li>Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , The MIT Press. 177-295 (1991).</li>
<li>Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-5+%28BMP-5%29+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li>
<li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li>
<li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+%28BMPs%29+and+BMP+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li>
<li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 177-205 (1991).</li>
<li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les avantages de ce modèle comprennent: (a) les cultures sont composées d&#39;une population homogène de neurones sympathiques dépourvus d&#39;autres types cellulaires 17,23; (b) les exigences du facteur de croissance des neurones sympathiques sont bien établies, ce qui permet l&#39;utilisation de milieu défini, et une variété de milieux définis, et les substrats fonctionnent bien pour la croissance et le maintien de neurones sympathiques 23; (c) les neurones dans ces cultures de répondre uniformém...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Lamelles de verre </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> 12 mm lamelle ronde n ° 1 Epaisseur de verre allemand </td></tr><tr><td> Bent pipettes pointe </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-lysine </td><td> Sigma </td><td> P0899-100MG </td><td> Solution stock 1 mg / ml </td></tr><tr><td> L&#39;eau distillée </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> Beaux-pince Dumont ne. 4 et 5 </td><td> Outils belle science (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 aiguilles de calibre </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz milieu L-15 </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Worthington </td><td> 4176 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Hank solution de sel équilibrée (Ca-,-Mg) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM faible taux de glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> L&#39;insuline / transferrine / Selenium </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Des acides gras libres BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Bioproduits Harlan </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> Jambon support F-12 nutriment (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11765 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Cytosine arabinoside </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td><td> Éviter la répétition des cycles gel-dégel </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D Systems Curis, Inc </td><td> 345-BP-07H BMP7 </td><td> PGO 4, 5 et 6 de travailler tout aussi bien que la BMP-7 et sont parfois plus faciles à obtenir dans le commerce </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Pêcheur </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> Souris anti-rat MAP2 anticorps </td><td> Sternberg monoclonaux Inc </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 de chèvre anti-souris </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> Milieu de montage </td><td> Prolongez sondes moléculaires kit Antifade </td> &lt;td&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

La forme de la dendritique arbre détermine l&#39;apport total synaptique d&#39;un neurone peut recevoir 1-3, et influe sur les types et la distribution de ces intrants 4-6. Modification des modes de croissance dendritique et la plasticité sont associés à la fonction neurocomportementale avec facultés affaiblies dans les modèles expérimentaux 7, et sont pensés pour contribuer à des symptômes cliniques observés dans les deux troubles neurodéveloppementaux 8-10 et les maladies neurodégénératives 11-13. Ces observations soulignent l&#39;importance fonctionnelle de la régulation précisément la morphologie dendritique, et suggèrent que l&#39;identification des mécanismes qui contrôlent la croissance dendritique ne sera pas seulement faire progresser la compréhension de la façon dont la connectivité neuronale est régulée au cours du développement normal, mais peut également donner un aperçu sur les nouvelles stratégies thérapeutiques pour diverses maladies neurologiques. Des études mécanistiques de la croissance dendritique serait grandement facilitée par la disponibilité osystème modèle FA qui permet aux neurones à titre expérimental est passé d&#39;un état ​​dans lequel ils ne s&#39;étendent pas aux dendrites celui dans lequel ils élaborent un arbre dendritique comparable à celle de leur homologues dans les in vivo. Les cultures primaires de neurones sympathiques dissociés de ganglions cervicaux supérieurs (SCG) de rongeurs périnatales fournir un tel modèle. Lorsqu&#39;elle est cultivée dans un milieu défini en l&#39;absence de sérum et les cellules gliales ganglionnaire, les neurones sympathiques d&#39;étendre un processus unique qui est axonale, et cet état ​​persiste pendant unipolaire semaines à plusieurs mois dans la culture 14,15. Cependant, l&#39;ajout de protéines soit morphogénétique osseuse-7 (BMP-7) 16,17 ou 18 à Matrigel le milieu de culture déclenche ces neurones d&#39;étendre les processus multiples qui répondent aux critères morphologiques, biochimiques et fonctionnelles pour les dendrites. Neurones sympathiques dissociés de la CTB de rongeurs périnatales et cultivés dans des conditions définies sont une population homogène de neurones 19qui répondent de manière uniforme à l&#39;activité dendrite-promotion de Matrigel, BMP-7 et autres PGB de la decapentaplegic (DPP) et 60A sous-familles 17,18,20,21. Important, le Matrigel-et BMP-induite dendrite formation se produit en l&#39;absence de changements de la survie des cellules ou la croissance des axones 17,18. Ici, nous décrivons comment mettre en place des cultures dissociées de neurones sympathiques provenant de la CTB de rats périnatales afin qu&#39;ils soient adaptés à l&#39;sélective dendrite-promotion de l&#39;activité de Matrigel ou MPG.

Nous décrivons un protocole pour l&#39;utilisation de protéines morphogénétiques osseuses-7 (BMP-7) ou Matrigel pour induire sélectivement la croissance dendritique dans les neurones sympathiques dissociés primaires des ganglions cervicaux supérieurs (SCG) de rats périnatales.

Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

La forme de l'arborisation dendritique détermine l'apport synaptique total qu'un neurone peut recevoir 1-3, et influence les types et la distribution de ces apports...

L'objectif de cette procédure est de cultiver des neurones sympathiques afin de pouvoir manipuler leur croissance dendritique. Cela est réalisé en isolant d'abord les ganglions cervicaux supérieurs de jeunes rongeurs péri-natals dans des conditions stériles. La deuxième étape consiste à dissocier les ganglions afin d'obtenir une suspension monocellulaire, qui est ensuite ensemencée sur les substrats préparés.Milieu défini Inde. Ensuite, après avoir traité les cultures avec un anti-mitotique afin d'éliminer les cellules non neuronales, traiter les cultures avec des BMP ou du Matrigel pour induire la croissance dendritique. Enfin, une double immunoréactivité est utilisée pour visualiser les dendrites étendues des neurones sympathiques en culture.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la culture primaire de neurones hippocampiques, réside dans la possibilité de manipuler l'état morphologique des neurones DYS de telle sorte que moins de 5 % des neurones en culture possèdent des dendrites, ou que plus de 95 % des neurones en culture présentent une forte élongation axonique. Pour préparer les cultures associées du ganglion cervical supérie

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C'est un protocole décrivant la façon d'isoler et de culture primaire de neurones sympathiques des ganglions cervicaux supérieurs (GCS) de ratons nouveau-né.

Protocole pour les neurones sympathiques de rat Culture ganglions cervicaux supérieur (SCG)

De nombreuses études récentes ont identifié des mutations dans les protéines synaptiques associés à des pathologies cérébrales. Primaire des cultures de neurones corticaux offrent une grande flexibilité dans l'examen des effets de ces protéines associées à la maladie sur la morphologie des épines dendritiques et la motilité.

L&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

Cette vidéo présente une méthode in vitro pour générer des neurones sympathiques postganglionnaires à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). Les hPSC sont différenciées en cellules de crête neurale (NCC) sur un support de matrice de membrane basale à l’aide d’un milieu de différenciation. Les NCC sont ensuite dissociés et formés en sphéroïdes à l’aide d’un autre milieu de différenciation. Enfin, les sphéroïdes sont transformés en neurones sympathiques postganglionnaires à...

Génération de neurones sympathiques postganglionnaires à partir de cellules souches pluripotentes humaines

La vidéo démontre la co-culture des neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) avec les cellules de Schwann. Les neurones DRG sont d’abord cultivés sur une membrane pré-étirée pour une croissance axonale alignée. Des cellules de Schwann sont ensuite introduites, qui se fixent aux axones, les isolant et favorisant la survie et la fonction des cellules neurales.

Co-culture de cellules de Schwann avec des neurones DRG sur une membrane pré-étirée

Cette vidéo démontre l’utilisation de cellules ganglionnaires de la racine dorsale transfectées pour étudier la libération de neurotransmetteurs en les stimulant avec un agoniste des récepteurs neuropeptidiques.

Stimulation des neurones sensoriels du ganglion de la racine dorsale à l’aide d’un agoniste du récepteur neuropeptide

Le protocole actuel présente des procédures expérimentales afin de stimuler les macrophages à être doté d’une capacité de libérer les facteurs moléculaires qui favorisent la croissance des neurites. Traitement du cAMP aux cultures neuron-macrophage co induit les macrophages pour produire un milieu conditionné qui possède une activité l’excroissance des neurites forte.

Neurone-Macrophage co-cultures d’activer les Macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec l’activité des neurites

Nous décrivons l’isolement, la dispersion et le placage des cellules primaires de pulpe dentaire (DP) avec les neurones trigéminaux (TG) cultivés au-dessus des filtres transwell. Les réponses cellulaires des cellules DP peuvent être analysées avec l’immunofluorescence ou l’analyse d’ARN/protéine. L’immunofluorescence des marqueurs neuronaux avec la microscopie confocale permet l’analyse des réponses de excroissance neurite.

Une méthode de co-culture pour étudier la croissance de la neurite en réponse aux signaux dentaires de paracrine de pulpe

Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie de différenciation stable et très efficace pour la génération de neurones sympathiques postganglioniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ce modèle rendra les neurones disponibles pour l’utilisation d’études sur de multiples troubles autonomes.

Différenciation efficace des neurones sympathiques postganglioniques utilisant des cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture sans alimentation et définies chimiquement

Cet article décrit l’isolement et la culture des neurones sympathiques embryonnaires de rat des ganglions cervicals supérieurs. Il fournit également des protocoles détaillés pour la coloration immunocytochimique et pour préparer des extraits neuronaux pour l’analyse spectrométrique de masse.

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonate Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Apprenez à cultiver des neurones sympathiques à partir de ganglions cervicaux supérieurs de rats périnataux et à induire leur croissance dendritique avec BMP-7 ou Matrigel. Cette méthode permet d'étudier la morphogenèse neuronale.

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