Name: Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Aprenda a criar microarrays de polímeros por fotopolimerização em chip para triagem de biomateriais. Este método permite avaliar resistência à adesão bacteriana e apoiar expansão de células-tronco.

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Financiamento do Wellcome Trust é gentilmente reconhecido (número de concessão 085245/Z/08/Z). Nottingham Nanotecnologia e Nanociência Centro é gentilmente reconhecido por dar acesso ao sistema Raman e para a Agência de Desenvolvimento de East Midlands para financiar este equipamento.

<ol><li>Hook, A. L., Anderson, D. G., Langer, R., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+methods+applied+in+biomaterial+development+and+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">High throughput methods applied in biomaterial development and discovery.</a> Biomaterials. 31, 187-198 (2010).</li>
<li>Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter-scale+synthesis+of+arrayed+biomaterials+and+application+to+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 22, 863-866 (2004).</li>
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<li>Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonising+new+frontiers-microarrays+reveal+biofilm+modulating+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers.</a> Journal of Materials Chemistry. 21, 96-101 (2011).</li>
<li>Yang, J., Mei, Y., Hook, A. L., Taylor, M., Urquhart, A. J., Bogatyrev, S. R., Langer, R., Anderson, D. G., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+surface+functionalities+that+control+human+embryoid+body+cell+adhesion+revealed+by+high+throughput+surface+characterization+of+combinatorial+material+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polymer surface functionalities that control human embryoid body cell adhesion revealed by high throughput surface characterization of combinatorial material microarrays.</a> Biomaterials. 31, 8827-8838 (2010).</li>
<li>Urquhart, A. J., Anderson, D. G., Taylor, M., Alexander, M. R., Langer, R., Davies, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+surface+characterisation+of+a+combinatorial+material+library%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">High throughput surface characterisation of a combinatorial material library.</a> Advanced Materials. 19, 2486-2491 (2007).</li>
<li>Taylor, M., Urquhart, A. J., Zelzer, M., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoliter+water+contact+angle+measurement+on+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Picoliter water contact angle measurement on polymers.</a> Langmuir. 23, 6875-6878 (2007).</li>
<li>Urquhart, A. J., Taylor, M., Anderson, D. G., Langer, R., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOF-SIMS+analysis+of+a+576+micropatterned+copolymer+array+to+reveal+surface+moieties+that+control+wettability%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TOF-SIMS analysis of a 576 micropatterned copolymer array to reveal surface moieties that control wettability.</a> Analytical Chemistry. 80, 135-142 (2008).</li>
<li>Hook, A. L., Yang, J., Chen, X., Roberts, C. J., Mei, Y., Anderson, D. G., Langer, R., Alexander, M. R., Davies, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylate+polymers+with+hydro-responsive+topography%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Acrylate polymers with hydro-responsive topography.</a> Soft Matter. 7, Forthcoming 7194-9197 (2011).</li>
<li>Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+cellular+morphology+and+biocompatibility+using+polymer+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays.</a> Biomedical Materials. 3, (2008).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

Microarrays de polímeros têm sido utilizados com sucesso para a descoberta de novos materiais por centenas de triagem de novo polímero em um ensaio biológico e identificar &#39;hit&#39; materiais que podem ser posteriormente ampliado para dispositivos úteis. Neste caso, a caracterização de superfície descritos, podem ser empregues para o subsequente ensaio biológico e exclusivamente sobre o &#39;hit&#39; materiais para estudar os materiais com mais detalhe. Esta estratégia pode ser de interesse se HTSC não está disponível para o experimentalista que emprega esta abordagem. No entanto, para utilizar totalmente microarrays de polímero de estudar materiais biológicos, interacções toda a matriz de centenas de materiais devem ser analisados ​​antes de ensaios biológicos que utilizam metodologias SCAT, os quais podem subsequentemente ser utilizados para observar gerais de estrutura-função de tendências. Impressão de contacto baseia-se no pino de metal de deslizamento para cima e para baixo livremente dentro do suporte de pino. Pin e pino limpeza titular é primordial é garantir pMPRIMIR ocorre com sucesso e deve ser rigorosamente realizada. Antes de se iniciar uma impressão execute o movimento apropriado do pino dentro do suporte de pino pode ser testado através da realização de um ensaio, sem monómeros presentes. O passo de limpeza deve continuar até que o movimento do pino é obtida de forma reprodutível. Considerável atenção deve ir para a concepção da mistura de monómeros. A fim de produzir facilmente uma biblioteca combinatória de polímeros, centenas de co-polímeros são formados por mistura de um monómeros de poucos em diferentes razões. Tipicamente nós produzimos 576 bibliotecas membros como esta forma uma matriz de 24 x 24, que é adequada para a geometria de uma lâmina de vidro. A fim de produzir uma biblioteca combinatória, que explora o espaço mais combinatório o método mais fácil é a mistura de monómeros 24 emparelhadas com uma proporção de 2:1. Alternativamente, a inclusão de gradientes de composição dentro da matriz são úteis para permitir que as observações de tendências, que permite que as composições de monómero a ser óptimos determined. Como um exemplo deste 22 monómeros podem ser utilizados como o primeiro componente de uma mistura de co-monómero que é sequencialmente diluídas com 1 de 6 segundos componentes. Se 5 diluições são usados, por exemplo misturando os primeiro e segundo componentes em proporções de 90:10, 75:25, 50:50, 25:75 e 10:90, isto resultaria em 488 soluções de copolímero únicas. Para levar o total de até 576, repetições dos homopolímeros dos monómeros utilizados podem ser introduzidos, o que muitas vezes é uma amostra de referência importante. 576 As soluções de monómero deve ser dispensado em 2 384 poços. Para a programação do robô é fácil ter duas placas idênticas em termos da posição dos monómeros, pelo que as soluções de monómero deve ser dividida entre as duas placas. Uma quantidade significativa de tempo pode ser guardado na preparação dos pratos de origem através da utilização de pipetas multicanal, e a concepção das placas de origem deve ser determinada de forma a explorar a utilização de pipetas multicanal. &lt;/ P&gt; Para alcançar HTSC automatizada das matrizes a posição à vista com êxito deve ser alinhado com o aparelho de caracterização. Tipicamente o passo de uma matriz de acrilato é 500-1000 um e o diâmetro do ponto de polímero é 300 um. A maioria das fases XY têm uma resolução inferior a 10 um, assim existe tolerância adequada para o aparelho de caracterização da superfície de forma fiável o acesso as posições da matriz uma vez que as dimensões correctas foram inseridos no programa posicionamento da amostra. A limitação ao posicionamento automatizado é, de facto, a impressão precisa de matriz. Para garantir a impressão precisa, é importante para evitar o movimento do substrato na fase de impressão, quer através de aspiração a vácuo ou grampos de mola, juntamente com as dimensões apropriadas de deslizamento (nota de que tanto um dos EUA e da UE tamanho do diapositivo padrão existe). ToF-SIMS é uma técnica extremamente superfície sensível que vai observar qualquer contaminação em amostras. Assim, o cuidado deve ser tomado upmostpara evitar o contacto com a superfície. As amostras só devem ser manuseados, mas a superfície de interesse não contactou com, com luvas limpas (de preferência polietileno) e com uma pinça recém-feita. Nós normalmente lavar com clorofórmio e hexano. Armazenamento da amostra antes da medição é melhor realizado em um suporte de amostras que contém as lâminas separadas, por exemplo o 5. Suporte de slides ou 20 porta-lâminas As matrizes são concebidas especificamente para ser compatível com muitos formatos de ensaios biológicos e leituras, ou seja, o substrato utilizado é uma lâmina de microscópio ideal para scanners de fluorescência e microscopia de luz. Isto significa que o formato é bem adequado para explorar vários materiais biológicos interacções. Além disso, o formato permite que centenas de materiais a serem examinados em paralelo. Isto permite que muitos materiais mais a ser rastreada que os métodos convencionais de química em que cada novo material é peneirado individualmente. A maior possibilidade biológico-material interações permitems para a elucidação dos mecanismos de interacções biológicas de superfície, bem como para encontrar o material óptimo para uma dada aplicação.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamento </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número do Modelo </td></tr><tr><td> Lâminas epóxi </td><td> Genetix </td><td> K2652 </td></tr><tr><td> Fale de impressora </td><td> Biodot </td><td> XYZ3060 Plataforma </td></tr><tr><td> Pino de metal </td><td> ArrayIt </td><td> 946MP6B </td></tr><tr><td> ToF-SIMS instrumento </td><td> ION-TOF </td><td></td></tr><tr><td> Instrumento XPS </td><td> Kratos </td><td></td></tr><tr><td> WCA aparelho </td><td> Krüss </td><td> DSA 100 </td></tr><tr><td> AFM </td><td> Bruker </td><td> Ícone dimensão </td></tr><tr><td> RPMI-1640 cultura meios celulares </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> SYTO17 </td><td> Invitrogen </td><td> S-7579 </td></tr></tbody></table>

microarrays de polímeros para discovery high throughput de biomateriais

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

De mistura é uma operação unitária, que combina dois ou mais componentes numa mistura homogénea. Este trabalho envolve a mistura de duas correntes de líquidos viscosos, utilizando um misturador estático em linha. O misturador é um desenho split-and-recombinam que emprega o fluxo de cisalhamento e extensional para aumentar o contacto interfacial entre os componentes. Um protótipo split-and-recombinam misturador (SAR) foi construído através do alinhamento de uma série de finas cortadas a laser poli (metacrilato de metilo) (PMMA), as placas mantidas no lugar em um tubo de PVC. Misturando neste dispositivo encontra-se ilustrada na fotografia na fig. 1. Corante vermelho foi adicionada a uma porção do fluido de teste e utilizados como o componente secundário sendo misturada no componente (não tingido) principal. Na entrada do misturador, a camada de fluido injectado traçador é dividida em duas camadas à medida que flui através da secção de mistura. Em cada secção subsequente de mistura, o número de camadas horizontais é duplicado. Em última análise, o único fluxo de corante é disperso uniformemente throughout a secção transversal do dispositivo. Usando um fluido de teste não-Newtoniano de Carbopol a 0,2% e um fluido de marcador dopado de composição similar, a mistura na unidade é visualizada utilizando imagem de ressonância magnética (MRI). A ressonância magnética é uma sonda muito poderoso experimental de química e molecular ambiente físico, bem como a estrutura da amostra nas escalas de comprimento de mícrons em centímetros. Esta sensibilidade resultou em ampla aplicação destas técnicas para caracterizar características físicas, químicas e / ou biológicas dos materiais que vão desde os seres humanos aos alimentos para meios porosos 1, 2. O equipamento e as condições utilizadas aqui são adequados para a imagiologia de líquidos que contenham quantidades substanciais de RMN 1 H móveis tais como a água normal e líquidos orgânicos, incluindo óleos. Tradicionalmente MRI tem utilizado de super imans condutores que não são adequados para ambientes industriais e não portátil, num laboratório (Fig. 2). Os recentes avanços in ímã tecnologia tem permitido a construção de grande volume ímãs industrialmente compatíveis adequados para fluxos de processos de imagem. Aqui, a ressonância magnética fornece concentração de componentes espacialmente resolvidos em diferentes locais axiais durante o processo de mistura. Este documento de trabalho em tempo real, a mistura de fluidos de elevada viscosidade, através da mistura distributiva com uma aplicação para produtos de cuidados pessoais.

Uma descrição da formação de um polímero de microarray utilizando uma técnica de fotopolimerização on-chip. A caracterização de superfície de alto rendimento utilizando a microscopia de força atómica, as medições do ângulo de contacto da água, raios-X e espectroscopia de fotoelectrões de tempo de voo de espectrometria de massa de iões secundários e um ensaio de ligação celular é também descrito.

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

A descoberta de novos biomateriais otimizados para uma aplicação biológica específica é facilmente alcançada utilizando microarranjos de polímeros, o que permite a ...

Este vídeo descreve um método para gerar e utilizar uma matriz microscópica de polímeros utilizando uma técnica de fotopolimerização em chip. Primeiro, lâminas de vidro são revestidas por imersão em poli(hidroxietil metacrilato) ou FEMA para produzir um substrato de baixa adesão. Monômeros são misturados em diferentes proporções para produzir uma biblioteca de soluções de monômeros.As soluções são transferidas para um formato de lâmina de vidro utilizando um dispositivo robótico de impressão e curadas com irradiação UV. O monômero polimeriza e o solvente é extraído a vácuo. Após a caracterização de superfície de alto rendimento, as microarranjos podem ser utilizadas para triagem do desempenho de materiais, como ensaios de adesão bacteriana.A análise de dados de adesão é um passo rumo à descoberta de novos biomateriais, destacando a utilidade do formato de microarranjo de polímeros. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, nos quais a resposta biológica de diferentes materiais é investigada, um material por vez, é a triagem paralela de centenas de materiais, que podem ser facilmente manipulados em um único lâmina. Esta técnica pode ser facilmente adaptada a diversos ensaios biológicos, como a triagem de materiais que resistem à adesão bacteriana ou que suportam a expansão de células-tronco.Essa técnica ajudou a descobrir materiais com aplicações potenciais para o suporte da expansão de células-tronco pluri-potentes em medicina regenerativa. Também estamos muito entusiasmados com a descoberta recente de materiais que resistem à adesão bacteriana e que têm potencial para reduzir a ocorrência de infecções associadas a dispositivos médicos. De modo geral, usuários novos no método terão dificuldade para otimizar as condições necessárias para imprimir um microarranjo, pois é difícil prever as condições ideais.Cometer erros mesmo em detalhes pequenos pode levar à obtenção de arranjos não utilizáveis. Também é essencial considerar qual cepa bacteriana e qual condição de cultivo serão utilizadas, pois a adesão e a morfologia do biofilme são específicas da espécie e do meio, podendo variar consideravelmente. Aqui, utilizamos aerogen como organismo modelo e um meio quimicamente definido para um ensaio de adesão bem controlado.Nossos colaboradores do MIT tiveram inicialmente a ideia deste método por meio da comparação com microarranjos de DNA e proteínas. Estes são bem estabelecidos para explorar seus respectivos espaços combinatórios biológicos. Dan e Bob perceberam que existia um espaço combinatório químico semelhante que precisava ser explorado a partir de materiais, demonstrando um procedimento que será conduzido por Andrew Hook e Chen Chang, pesquisadores pós-doutorais em nosso projeto financiado pela Welcome Trust. Inicie este procedimento preparando um fundo de baixa adesão.Esta é uma superfície que resiste à adesão de biomoléculas, como proteínas e células. Pese dois gramas de poli(hidroxietil metacrilato) ou FEMA em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, complete o volume para 50 mililitros com etanol a 95% em água.Em seguida, coloque o tubo em um agitador por cerca de 24 horas ou até que o FEMA esteja completamente solubilizado, segurando o bastão de vidro com pinças. Mergulhe no vidro funcionalizado com epóxi. Mergulhe na solução de FEMA para cobrir todo o comprimento, exceto cinco milímetros.Os grupos epóxi formam ligações covalentes com o revestimento de FEMA. A porção não revestida pode servir como controle positivo durante um período de um segundo. Retire a lâmina da solução de FEMA, em seguida inverta a lâmina e coloque-a em posição quase horizontal para secar.Uma vez que a lâmina esteja seca, coloque-a em um suporte para lâminas. Deixe as lâminas revestidas com FEMA em condições atmosféricas por uma semana para permitir a completa evaporação do solvente. Em seguida, para preparar as soluções de monômero, pipete cinco microlitros de solução de iniciador fotossensível e 15 microlitros de monômeros de acrilato e metacrilato solúveis em dimetilformamida em uma placa-fonte de 384 poços.Um volume total de 20 microlitros é ideal para a formação de manchas. Agora que as soluções foram preparadas, utiliza-se um robô de impressão por contato com estágio X, Y, Z para gerar o micromatriz. O robô utiliza pinos ranhurados com diâmetro de 220 micrômetros que contêm fendas funcionando como reservatórios para a transferência da solução.Inicie colocando os pinos e o suporte dos pinos em um recipiente contendo diclorometano por 10 minutos. Em seguida, após permitir que os pinos sequem, reconecte o suporte à cabeça de impressão. A seguir, carregue os pinos no suporte.Em seguida, carregue 10 lâminas de vidro para blotting e lâminas revestidas com FEMA no robô. Normalmente, três matrizes replicadas são impressas em cada lâmina. Em seguida, utilizando tubos, conecte a estação de lavagem do robô a uma garrafa contendo 2,5 litros de dimetilformamida fresca.Carregue a placa contendo a solução de monômero no robô. Preencha completamente a câmara do robô com Argônio para reduzir o nível de oxigênio a abaixo de 2000 PPM. Nesse nível baixo, os radicais de polimerização não devem ser extintos pelo oxigênio.Utilizando um dispositivo regulador de umidade, ajuste a umidade para ser mantida entre 30 e 40% na câmara do robô; incluir umidade permite que o FEMA inche, possibilitando que o polímero formado interpenetre a camada de FEMA e fique fisicamente aprisionado na superfície. Para iniciar a impressão, clique em "ir" no software com o computador associado. Os pinos então descerão para dentro das soluções de monômero a uma velocidade de 25 milímetros por segundo.Em seguida, eles serão mantidos em solução por 2,5 segundos e recolhidos a uma velocidade de 25 milímetros por segundo. A seguir, a extremidade do pino é colocada em contato com as lâminas FEMA, dispensando aproximadamente 2,4 nanolitros de solução da parte do pino correspondente ao coxim. O tempo total de contato para cada contato é de 10 milissegundos, e a velocidade de aproximação e recuo é de 175 milímetros por segundo.Em seguida, os pinos são secados por meio de contato repetido com lâminas de vidro para remoção da solução de monômero da superfície externa dos pinos. A sequência de secagem utilizada consiste em 33 contatos com uma lâmina de vidro limpa. As quatro primeiras posições farão 10, 5, 4 e 3 contatos, respectivamente.As próximas quatro posições farão dois contatos, e as últimas três posições farão um contato após a impressão. Os pinos são lavados em um banho de fluxo de DMF com agitação por 30 segundos. Concomitantemente, as lâminas impressas são irradiadas com uma fonte de UV de onda curta de 365 nanômetros a uma densidade de 30 milivolts por centímetro quadrado.Após a conclusão da lavagem e irradiação, o próximo lâmina é impresso. Se a impressão parecer bem-sucedida, irradie os arranjos com UV a 365 nanômetros por mais 10 minutos. Os arranjos recém-impressos são colocados em uma estufa a vácuo ajustada para menos de 50 millitorr por uma semana para remover monômero não polimerizado e solvente após a impressão e extração a vácuo.O sucesso da polimerização das manchas poliméricas pode ser avaliado por microscopia óptica simples para identificar quaisquer morfologias anômalas das manchas; normalmente, as manchas devem apresentar-se circulares e uniformes, como mostrado nesta figura à esquerda. A causa provável de uma alteração na geometria é uma ponta danificada ou suja ou um contaminante particulado nas soluções de monômero. Caso isso ocorra, o processo terá de ser repetido para um pequeno número de combinações de monômeros.Pontos deformados podem ser observados, por exemplo, um ponto central com um satélite de pequenos pontos mostrado à direita ou uma forma semelhante a um ovo frito, na qual há um ponto central sobreposto a um ponto maior e mais achatado. Isso pode ser causado por separação de fases antes da impressão, relacionada a diferenças na viscosidade, hidrofilicidade, volatilidade ou tensão superficial dos monômeros, e sugere que a combinação de monômeros não é compatível com este formato. A mapeamento químico adicional dos pontos de polímero também é uma etapa importante e, às vezes, necessária de controle de qualidade para determinar a distribuição das químicas dos materiais ao longo dos pontos e a caracterização de superfície de alto rendimento ou HTSC dos microarranjos gerados.O uso dessa técnica também permite correlacionar o desempenho biológico com propriedades físico-químicas. Isso possibilita o estudo da interação de materiais biológicos. A HTSC utiliza medições do ângulo de contato com água, tempo de voo, espectrometria de massa de íons secundários, microscopia de força atômica e espectroscopia fotoeletrônica de raios X.Em particular, a SIMS de tempo de voo fornece uma análise quimicamente rica da amostra, que pode ser usada para correlacionar a resposta celular com uma porção molecular. Em alguns casos, o desempenho biológico pode ser previsto. Os espectros de SIMS de tempo de voo demonstram a dependência química da interação de um material biológico e orientam o desenvolvimento de materiais com interface humana (HI).Uma vez que a superfície do microarranjo polimérico tenha sido caracterizada, ela pode ser utilizada para o estudo de interações biológicas. Aqui demonstramos o uso do microarranjo na realização de um ensaio de adesão bacteriana. Inicie inoculando 10 mililitros de LB com uma única colônia de pseudomonas marcada com GFP.Os Aerogen crescem a 37 graus Celsius com agitação a 200 RPM durante a noite. Meça a DO 600 da cultura bacteriana de overnight e dilua a cultura até uma DO 600 de 0,01 em 15 mililitros de RPMI 1640. Enquanto isso, lave as lâminas do arranjo e esterilize água destilada por 10 minutos para remover quaisquer componentes solúveis dos arranjos, como monômeros não polimerizados, todos os ligantes e solvente.Em seguida, seque os lâminas ao ar em uma cabine de fluxo laminar. Depois, coloque os lâminas do micromatriz lavados em uma placa de Petri limpa e esterilize-os por UV por 10 minutos. Quando o cultivo bacteriano estiver pronto, transfira o lâmina com a micromatriz para uma placa de Petri e adicione 15 mililitros do meio RPMI 1640 inoculado.Coloque outro lâmina com arranjo em uma segunda placa de Petri e adicione 15 mililitros de RPMI 1640 estéril como controle. Incube as placas a 37 graus Celsius por 72 horas com agitação a 60 RPM após a incubação. Lave as lâminas três vezes com 15 mililitros de PBS estéril durante cinco minutos a 100 RPM.Em seguida, lave as lâminas duas vezes com 15 mililitros de água destilada estéril para remover o sal fosfato. Após a lavagem, deixe as lâminas secar ao ar em uma cabine de fluxo laminar.Uma vez que as lâminas estejam secas, elas devem ser lidas por um escâner de fluorescência o mais rápido possível para evitar a degradação da GFP, utilizando a tecnologia de imagem e o software apropriados. A fluorescência devida à adesão bacteriana é calculada subtraindo-se a fluorescência do controle contendo apenas o meio da amostra inoculada, a fim de identificar materiais que resistam à adesão bacteriana.Microarranjos foram gerados e ensaios de adesão bacteriana foram realizados de acordo com os métodos descritos neste vídeo. Como visto aqui, o microarranjo de polímeros contém materiais com baixa adesão bacteriana, que apresentam baixa fluorescência, e alta adesão bacteriana, que apresentam alta fluorescência. Os três arranjos mostrados aqui são réplicas; quando os valores de fluorescência das três réplicas são médias, são apresentados como uma representação tridimensional.Como mostrado aqui, a interpretação visual quantitativa é simplificada. A escala de intensidade à direita representa os valores dos dados de fluorescência. Em um nível básico, identificar os materiais com baixa fluorescência fornece um meio para identificar rapidamente materiais que atendem a uma aplicação biológica específica, como resistir à adesão bacteriana.No entanto, esses resultados também podem ser combinados com a triagem de alto rendimento de materiais (HTSC) para investigar correlações entre propriedades específicas dos materiais e seu desempenho biológico. Essa análise pode elucidar as relações entre estrutura e função, identificando assim os mecanismos subjacentes à interação biológica com os materiais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como se preparar e imprimir uma matriz microscópica de polímeros, além de obter uma visão sobre a forma como essas matrizes podem ser utilizadas para investigar a resposta bacteriana aos materiais.Uma vez dominada, uma matriz microbiana de polímero pode ser impressa em dois dias, se realizada corretamente. O preparo dos monômeros leva aproximadamente um dia e a impressão da matriz leva cerca de seis horas. O ensaio de adesão bacteriana leva cinco dias, o que aumenta o tempo necessário para cultivar a cultura sobreposta como inóculo. Incubando a micromatriz na cultura bacteriana por 72 horas e detectando o sinal utilizando um escâner de micromatrizes, está tudo certo. Ao realizar este procedimento, é importante manter o pino e os suportes dos pinos limpos.É muito frustrante se, na metade de um experimento, o pino ficar preso em posição vertical e não conseguir mais fazer contato com a superfície porque o pino ou o suporte do pino não foram limpos adequadamente. Não se esqueça de que trabalhar com DMF e monômeros tóxicos pode ser extremamente perigoso, e precauções como a exaustão devem sempre fazer parte do procedimento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap para a realização de imunoensaios sanduíche multiplexado cross-reactivity-livre simplesmente estalar dois slides. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagentes de microarray-para-microarray. O chip de pressão pode ser usado para qualquer reações bioquímicas que exigem colocalization de diferentes reagentes sem contaminação.

Snap o Chip para imunoensaios livre de Cross-reactivity e Spotter sanduíche multiplexado

Aqui, apresentamos um protocolo para tela extracelular da proteína microarrays para identificação de interações ligante-receptor romance em alta taxa de transferência. Também descrevemos um método para realçar a deteção de interações da proteína-proteína transiente usando complexos proteína-Microconta.

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Microarray polymer profiling (MAPP) é uma técnica de alto rendimento para análise composicional de glicanos em amostras biológicas.

Perfil de polímero de microarray (MAPP) para análise de glicanos de alto rendimento

Aprenda a criar microarrays de polímeros por fotopolimerização em chip para triagem de biomateriais. Este método permite avaliar resistência à adesão bacteriana e apoiar expansão de células-tronco.

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

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