פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבחון את ההשפעות של עגבניות Pseudomona siro PV על חלבונים המווסתים על ידי חמצון חיזור בצמחי עגבניות. ראשית יש לחסן צמחי עגבניות בעגבניות Pseudomona siro PV PV כדי לגרום לזיהום פתוגן ותגובת חלבון. המשך לצבוע עם DIAM benzine כדי לצפות בשינויים במיני חמצן תגובתיים.

לאחר מכן בצע תיוג TMT של ציסטה על מנת לבחון ציסטאין מווסת חמצון חיזור בחלבונים. התוצאות המתקבלות יכולות למדוד שינויים בין דגימות מטופלות לביקורת. היי, אני צ'ן מהמחלקה לביולוגיה ופרוטאומיקה כאן באוניברסיטת פלורידה.

היתרון של תיוג ה-CTMT שלנו על פני השיטה הקיימת כגון תג סנפיר מצופה איזוטופ, הידוע גם ASCA, הוא היכולת לבצע ריבוי תוך ניתוח חלבונים המגיבים לחמצון חיזור בקנה מידה גדול. בעוד שהדגמה זו תספק תובנות לגבי חלבונים המווסתים על ידי חמצון חיזור עגבניות בתגובה לזיהום פתוגני, ניתן ליישם את הניסוי על מערכות אחרות כגון ג'וף, עכברים cu וצמחים אחרים ושליטה בתנאי לחץ. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה לאחר שראינו שונות ניכרת בין ניסויי ICAD מכיוון שרק שני תגים זמינים.

הדגמת VIR של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי התיוג וההעשרה. יש למזער את השינויים הניסיוניים בין דגימות מסומנות ולהסיר אזורים מצמצמים כדי להבטיח תיוג יעיל, בואו נתחיל. גדל שני שתילי עגבניות מושתלים בגודל דומה בעציצים בקוטר ארבעה סנטימטרים לתרבית החיסון.

מדשאה של פסאודומונה סינג על צלחת KBM. מגרדים את החיידקים ל-20 מיליליטר מים ומכינים חיסון חיידקים של כ-10 עד שש יחידות יוצרות מושבה למיליליטר. בליטר אחד של חיסון טובלים את הצמחים בני ארבעה שבועות בתמיסת החיסון החיידקי למשך 30 שניות.

לאחר מכן מכסים מיד בשקיות ניילון שקופות. לאחר זמן החיסון המועדף, קצרו את העלה המורחב במלואו את צד האפידרמיס כלפי מעלה במיליגרם אחד למיליליטר, כתם DAB ווואקום חודרים למשך 15 דקות. ואז דגרו עלים בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

כעת מרתיחים את העלים המוכתמים באתנול 95% למשך 10 דקות ומאחסנים באתנול 75% באמצעות טחינת מרגמה. העלים שנקטפו לאבקה דקה בחנקן נוזלי. לאחר מכן בצע מיצוי פנול כמתואר בטקסט הנלווה.

לאחר מכן, זרז חלבונים מיצוי פנול עם חמישה נפחים של אמוניום אצטט קר 0.1 מולארי ב-100% מתנול. קצרו את החלבונים על ידי צנטריפוגה, בצעו שטיפות גלולות. לאחר מכן השעו מחדש דגימות ב-1.5 מיליליטר קר, 70% אתנול והעבירו לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר.

לאחר הצנטריפוגה, השליכו את האתנול וייבשו את הגלולה לזמן קצר בוואקום מהיר להמיס דגימות במאגר מיצוי חלבון דנטור לאחר צנטריפוגה ליצירת גלולה, לאסוף את הסופינט ולמדוד את הסופרנטנט ולמדוד את ריכוז החלבון על פי מדריך היצרן. עבור כל אחד מששת תגי המסה, התחל עם 100 מיקרוגרם של דגימת חלבון בנפח שווה של מאגר אלקילציה של 200 מילי-מולרית IO אצטמיד כדי לחסום את קבוצות התיול החופשיות בדגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן כדי לזרז את החלבונים, הוסיפו מיליליטר אחד של קור, 80% אצטון והניחו מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

גלולה את החלבון על ידי צנטריפוגה ובצע שלוש שטיפות עם 80% אצטון. לאחר ייבוש דגימות באוויר על קרח, ראוס השהה את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של מאגר ליזה. לאחר מכן כדי להפחית את קשרי הדיססולפיד, הוסף 0.5 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי TCEP ודגר למשך שעה אחת של טמפרטורת החדר.

המיס את התגים על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של אצטו ניטריל לצינורות המגיבים. מערבולת וסובב למטה הבא כדי להסיר עומס TCEP נוסף 50 מיקרוליטר של דגימה על עמודת MicroCon שלושה KD. הוסף 50 מיקרוליטר של ליזה, חיץ וצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-10, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.

כדי לאסוף את הדגימה, הסר את העמודה הפוכה לצינור נקי וצנטריפוגה. בדוק את ה-pH של הדגימה במידת הצורך. מתאם בין pH שבע לשמונה עם הידרוכלורי מולארי אחד.

הוסף חמישה שחרור מיקרו של מגיב הציסטה TMT ודגר את התגובה למשך שעתיים של טמפרטורת החדר, שלב דגימות והוסף נפח שווה של מאגר דגימת לאלי מרתיח במשך חמש דקות והפריד על ג'ל פולי אקרילאמיד 12% לאחר שטיפת הג'ל שלוש פעמים עם כתם מים מסונן עם כחול קומאסי למשך שעה ועיכוב לילה במים על סמך ריכוזי רצועת החלבון. חלקו 12 שברים לכל נתיב ג'ל. קוצצים כל שבר לחתיכות מילימטר אחד ומניחים בצינור של 1.5 מיליליטר.

עצרו לחלוטין את חתיכות הג'ל עם 0.1 אמוניום ביקרבונט מולארי ב-50% אצטו ניטריל. כעת מכסים את החלקים ב-100% אצטו ניטריל למשך 15 דקות. מוציאים את הנוזל ומייבשים את החלקים באמצעות שואב מהירות.

לאחר מכן, הוסיפו נפח שווה של תמיסת טריפסין והניחו על קרח כדי להתייבש. לאחר מכן דגרו על 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות לעיכול טריפטיכון. לאחר מכן, הסר את תמצית החלבון הנוזלי מהדגימות המודגרות.

עצור את התגובה והסר את כל עיכול החלבון שנותר על ידי כיסוי חתיכות הג'ל ב-5% חומצה פורמית, 50% אצטו ניטריל. לאחר מכן מנערים את חתיכות הג'ל למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הסופינאט לצינורות דגימת החלבון שחולצו לאחר שתי מיצוי נוספות.

יבש את הדגימות תחת שואב מהירות בצינורות של 0.5 מיליליטר. הכן 50% slurry של שרף אנטי TMT ב-TBS בריכוז פרופורציונלי לעוצמת רצועת החלבון המתאימה. שטפו את השרף שלוש פעמים בנפח עמודה אחד של פעם אחת TBS המשיכו להוסיף 200 מיקרוליטר TBS לכל דגימה.

לאחר מכן מעבירים לשרף אנטי TMT ומערבבים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, ולאחר מכן מתנדנדים למשך הלילה של ארבע מעלות צלזיוס. טען כל דוגמה בעמודה. בצע שטיפות עמודים של 200 מיקרוליטר כל אחת.

לאחר מכן יש להוציא כל דגימה שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של מאגר פליטה של 50% ולייבש בוואקום. ריס, השעו את הדגימות ב-12 מיקרוליטר של 3% אצטו ניטריל עם 0.1% חומצה פורמית והזריקו חמישה מיקרוליטר ישירות על עמודת HPLC. סילוק פפטידים באמצעות שיפוע של הגדלת אצטו ניטריל כמפורט בטקסט הנלווה.

השתמש בספקטרומטריית מסה כדי לזהות פפטידים בזרימת עבודה של שניים על שלושה המובילים. התחל עם שלב יחיד ms. לאחר מכן רכוש שלושה ספקטרום Ms.Ms עם אנרגיה גבוהה יותר C לכוד דיסוציאציה פיצול ואחריו שלושה.

Ms.MS עם דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות לזיהוי חלבון. נתח את נתוני המפרט ההמוני באמצעות זרימת עבודה מסועפת. יישם כמת ברזל מדווח כדי לכמת את היחס.

עבד גם את ספקטרום MSM MS באמצעות מנרמל הספקטרום של בורר הספקטרום וצמתי קבוצת הספקטרום שאילתות נתונים מול מנוע החיפוש seaquest. תמונה זו מציגה דוגמאות של עלה צמח עגבנייה מבוקר משמאל ועלה מחוסן פסאודומונס מימין לאחר שהעלים מוכתמים באמצעות DAB. תהליך הצביעה של DES מאפשר לצביעה ההיסטוכימית להראות סימנים של מיני חמצן תגובתיים ברקמת העלה.

כצפוי, הבקרה אינה מראה צביעה משמעותית בעוד שהעלים שטופלו בפסאודומונס מכתימים חיוביים לייצור מי חמצן. דוגמה זו מציגה פלט נתונים של גילוי פרוטאום של אזור שיא חלבון מווסת חמצון חיזור דיפרנציאלי עבור כל דגימה מאפשר כימות מוחלט. אזור השיא בין דגימות ביקורת לדגימות מחוסנות מצביע על כמויות יחסיות.

כאן, ויסות חמצון חיזור של חלבון בין דגימת ביקורת לדגימה מחוסנת דומה. שיאים בעוצמה דומה מרמזים על נוכחות של קשרי דיס סולפיד שאינם מוסדרים על ידי שינוי בטיפול. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו כראוי תוך שבוע אחד.

זכור לשמור על דגימות קרות ולשמור על תוויות מסודרות. כמו כן, יש לנקוט באמצעי זהירות בעת שימוש בפנול כגון כפפות ניסיון נדנוד ועבודה במכסה המנוע לאחר הליך זה. ניתן לבצע אמצעים אחרים כמו ניתוח ספקטרומטריית מסה ספציפית של שינויים לאחר תרגום על מנת לקבוע שינויים אחרים במערכת כמו חומצה אונית וסימולציה של גלוטן.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הפעלת CTMD בעמידה DIB והסמכת חמצון חיזור 16.