Name: 실란 커플링 에이전트를 사용하여 실리카 광 Biosensors에 생물 학적 프로브를 부착 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 배우세요 실란 커플링 에이전트를 이용한 실리카 광학 공명기 표면의 바이오틴 공유 결합 부착 방법입니다. 산소 플라즈마 또는 피라나 에칭으로 수산기화한 후 NHS 에스터 화학으로 바이오틴을 결합하여 고감도 광학 바이오센서를 제작합니다.

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저자들은 기꺼이이 프로토콜이 개발되었다 시간 동안 지원 남부 캘리포니아 대학에서 교수 안드레아 아르마니을 인정합니다. 이 작품의 초기 개발을위한 기금은 국립 과학 재단 (NSF)에 의해 제공되었다 [085,281 및 1,028,440]와 NIH 원장의 새로운 혁신 보너스 프로그램을 통해 건강의 국립 연구소 [1DP2OD007391-01]. 자세한 내용은에서 구할 수있다 <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/ ~ hunthk /</a> .

1. 배경 비오틴은 간단한 3 단계 과정 (그림 1)를 통해 이러한 장치의 표면에 붙어있다. 첫째, 우리는 표면을 청소하고 산소 플라즈마 또는 고생 솔루션 중 하나에 장치를 노출하여 히드록실 그룹과 그것을 채웁니다. 둘째, 우리는 가수 분해와 축합 반응을 통해 히드록실 그룹에 일차 아민과 종료 실란 커플링 에이전트를 장착 증기 증착법을 사용합니다. 셋째, 우리는 N-hydroxysuccinimide (보건국) 에스테르 화학을 통해 표면에 비오틴을 첨부합니다. 우리는이 기술을 이용해 주셔서 더욱 이러한 기술의 발전에 대한 정보뿐만 아니라, 우리의 동기에 대한 설명에 대한 우리의 이전 작업에 관심있는 독자를 안내할 8. 이러한 반응의 성공뿐만 아니라, 비오틴의 추가 후 일차 아민의 추가 후 광학 및 형광 현미경을 통해 평가할 수있다. 동안 광학 m표면 작용화 프로토콜도 microsphere 표면, 또는 오염 물질의 손상이 발생한 경우 icroscopy를 결정하는 데 사용할 수 있습니다, 형광 현미경은 비오틴 분자의 표면 커버 리지의 품질과 균일를 확인하는 데 사용뿐만 아니라, 비오틴의 기능에있다 표면 (strept) 아비딘으로 바인딩합니다. 표면에 아민의 범위를 평가하기 위해, 우리는 microsphere에 안정적이고 공유 결합 티오 우레아 연계를 형성하는 데 일차 아민과 반응 플루오​​레신 isothiocyanate (FITC) 형광 염료을 사용 하였다. 아비딘으로 복합되었습니다 텍사스 적색 형광 염료는 비오틴 - 아비딘 상호 작용을 통해 표면에 비오틴 그룹 레이블을 지정하는 데 사용됩니다. 두 경우 염료가 그 표면에 기능성 그룹과 (수용체 - 리간드 상호 작용이나 공유 결합 본딩 중 통해) 상호 작용할 수 선정되었습니다. 여기 세 떠나 단체와 하나 기능성 그룹을 가진 실란 커플링 에이전트, 다리 베팅을 제공합니다무기 표면 및 유기 프로브 분자를 기대하다. 일차 아민 기능은 안정적인 아미드 유대 관계를 형성 보건국의 에스테르와 정량적 반응. 이 경우, 우리는 누구의 발레르 사이드 체인 NHS 에스테르 그룹과 수정되었습니다 비오틴 프로브 분자를 사용합니다. 현실에 어떠한 프로브 분자는 NHS 에스테르 그룹은 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 표면에 추가할 수 있습니다. 또한 이러한 프로토콜은 일반적이며, 비오틴과 함께 모든 실리카 장치 표면을 functionalize하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 프로토콜과 주요 과제는 오히려 실리카 microspheres의 처리에 화학 자체가 사실이 아닙니다. 프로토콜에 걸쳐, microspheres는 날카로운 스쳐 핀셋으로 가볍게 자신의 줄기를 grapsing에 의해 다루어 져야합니다, 양해해 주시기 바랍니다. 이것은 아주 멀리 microspheres 자체에서 족집게를 유지하고, 단계 사이에 쉽게 전송을 허용합니다. 아래의 프로토콜의 많은 단계가 구체적으로이 사실에 대응하도록 고안되었습니다또는. 2. Microsphere의 제조 <ol><li> microspheres를위한 스토리지 주택을 빌드합니다. <ol><li> 이것은 일반적인 크기의 유리 슬라이드에 테이프를하며 끝을 롤을 형성 충족과 함께 스카치 테이프 부분에 1을 첨부, exacto 나이프 사용하여 사각형에 X 1의 1에 골판지의 두께 조각의 ¼ 잘라 , 골판지 있습니다. </li><li> 이것은 microsphere가 주변 환경에서 상승과 격리 수있는 플랫폼을 만들고, 그들의 표면에 손상을 방지할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 가위를 사용하여 광섬유의 스풀에서 광섬유의 3 인치 부분을 절단. </li><li> 아 - 닉 섬유 - 리퍼를 사용하여 바로 실리카 코어를 떠나, 섬유의 절단 부분의 끝 부분의 마지막 0.5 인치로부터 보호 고분자 코팅을 벗겨. Kimwipe로 남아있는 폴리머의 표면을 깨끗이 부드럽게 Kimwipe과 섬유질을 닦아하여 메탄올과 dampened. </li><li> 베어 섬유 식칼 사용 송두리째 끝을 이렇게 잘라 일불과 1에서 송두리째 섬유 mm은 섬유의 끝 부분에 남아 있습니다. </li><li> 수직으로 갔지만 끝이 아래로 향하게되는 등 섬유를 정렬하기 위해 간병, CO 2 레이저의 경로로 광학 섬유를 벗기고 끝부분을 놓습니다. </li><li> CO 2 레이저를 켜고 광학 섬유의 옷을 벗긴 끝 표면에 직접. 레이저 2 초 약 3.5 %의 전력을 사용하여 둥근 모양으로 섬유를 벗기고 끝을 녹여 것입니다. </li><li> 족집게 사용 microsphere의 줄기를 (광섬유의 비 막았죠 부​​분) 신중을 파악. microsphere 주택에 테이프 롤로 줄기를 연결합니다. 유리 슬라이드는 배양 접시에 자신을 저장할 수 있습니다. 이것은 microsphere의 안전한 보관을 허용합니다. </li></ol> 3. 히드록실 그룹으로 표면을 채우지 <ol><li> 고생 솔루션을 사용 : <ol><li> 힌지 캡과 60 ML의 폴리 프로필렌의 약병에서 H를 발연 량으로 (70:30을 고생 솔루션을 준비 <sub&gt; 2 SO 4 : 황산 발연의 11.6 ML 다음, 유리병에 과산화수소 5 ML를 추가하여 H 2 O 2 (30 wt %)를.) 주의 : 산성 방지 장갑을 착용하십시오. </li><li> 유리병에, 최소한 1 microsphere를 개최, 유리 슬라이드를 전송합니다. microsphere는 액체와 접촉에 있어야하지만, 액체가 마분지를 만지지 않습니다. 필요한 경우 솔루션의 볼륨을 조정합니다. </li><li> 부드럽게 유리병의 유리 덮개를 제거하고 DDI H 2 O를 포함하는 다른 플라스틱 약병에 삽입 샘플 5 분간 용액에 앉아 보자. </li><li> 부드럽게 유리병의 유리 슬라이드를 제거하고, 80시 10 분 ° C가 표면을 건조하기 위해 오븐에 넣으십시오. </li></ol></li><li> 산소 플라즈마 처리를 사용 : <ol><li> 산소 플라즈마 챔버에 적어도 하나의 microsphere를 포함하는 유리 슬라이드를 전송합니다. </li><li> 200 mTorr의 산소 압력과 전력 120 W에 2 마일을 위해 산소 플라즈마에 시료를 폭로를 설정이야기야. </li><li> 플라즈마 챔버에서 유리 슬라이드를 제거합니다. </li></ol></li></ol> 4. 표면에 실란 커플링 에이전트를 부착 <ol><li> 퓸 배출 후드의 진공 건조기에 적어도 하나의 microsphere를 포함하는 유리 슬라이드를, 놓으십시오. </li><li> 또한 연기 후드에 실란 커플링 에이전트 병 (이 경우, aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)가 사용되었다) 연 건조기에서 열린 병을 놓습니다. </li><li> 진공 건조기에 뚜껑을 교체하고, 흡인기이나 집 진공 라인에 아울렛 포트를 연결합니다. </li><li> 집 진공 또는 물 라인 켜고 진공 건조기에서 철수. 진공 밀봉은 뚜껑과 받침대 사이에 형성되면 반응 타이밍을 시작합니다. 이것은 박막 등의 표면에 실란 커플링 에이전트를 입금합니다. </li><li> 십오분 후 진공을 해제하고, 천천히 건조기에 공기를하도록 포트를 엽니다. 이 커플링 에이전트의 경우 15 분 unifo를 형성​​하기에 충분표면 RM 단일층. 다른 커플링 요원의 경우 시간 조정해야 할 수도 있습니다. </li></ol> 5. 표면에 비오틴을 부착 <ol><li> 한 시간 정도 비오틴을 부착하기 전에 힌지 캡과 함께 60 ML의 폴리 프로필렌의 유리병에 무수 dimethylsulfoxide (DMSO)에 N-hydroxylsuccinimide 비오틴 (NHS-비오틴)의 10 MM 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 보건국-비오틴은 차가운 저장 되었다면, 그것을 조직하고 전에 실온에 평형 수 있습니다. </li><li> 완전히 용매에 보건국-비오틴 분말을 용해하기 위해 1 시간 정도 솔루션을 Sonicate. </li></ol></li><li> 하단에있는 microspheres와 다른 플라스틱 약병에 microsphere를 포함하는 유리 슬라이드를 전송하고, 약병의 상단 때문이다. </li><li> 유리 슬라이드 (그것은 유리병에 추가되고 있기 때문에 솔루션 microsphere를 만지지 않는다) 뒤에 유리병의 측면 아래로 플라스틱 pipet, 보건국-비오틴 솔루션의 적절한 볼륨을 사용하여 전송.microsphere 표면을 충당할 DD 충분한 솔루션입니다. </li><li> 각각, 5 rpm을 5 도에서 속도와 기울기의 각도로, 실온에서 30 분간 이제 요동 인큐베이터에 DMSO 용액에 microspheres 및 보건국-비오틴이 포함된 유리병 (틸트 트레이)를 놓습니다. </li><li> 부드럽게 유리병에서 유리 슬라이드를 제거하고 부드럽게 DDI H 2 O에 가득 다른 유리병으로 밀어 이전과 동일한 속도와 기울기 각도에서 또 다른 10 분 틸트 트레이에 병을 놓습니다. 신선한 물로 두 번 할 때마다이 단계를 반복합니다. 이것은 표면에서 과잉 DMSO를 제거하는 데 도움이, 그리고 표면 실제로 그라 프트 아니 신체적-adsorbed 비오틴을 제거합니다. </li><li> 유리병에서 유리 슬라이드를 제거하고 모든 물방울이 표면에서 제거됩니다 ° C에서 10 분, 또는 때까지 80에서 오븐에 넣습니다. </li></ol> 6. 아민 - 종료 실리카의 형광 라벨링 <ol><li> treatm 후 현재 아민 그룹 레이블을 지정하려면APTMS있는 엔트는 1, ML 무수 DMSO에 1 밀리그램 FITC을 해소하여 어두운 방에 FITC 솔루션을 준비합니다. </li><li> 0.1 M 나트륨 중탄산염 버퍼 1 ML에 FITC 용액의 50 μL를 추가하여 6.1의 솔루션을 희석. </li><li> 힌지 캡과 함께 60 ML의 폴리 프로필렌의 유리병에 솔루션을 놓고 부드럽게 유리병에 유리 슬라이드에 다시 보관되어 아민-종료될 microspheres를, 슬라이드. </li><li> 얼음 욕조에 병을 놓고 예제는 어둠 속에서 4 시간 최소 FITC 솔루션으로 반응하자. </li><li> 나트륨 탄산 버퍼에 microspheres의 두 십분 물에 빨고 통해 초과 형광단를 제거합니다. 이전으로 버퍼와 힌지 캡과 함께 60 ML의 폴리 프로필렌의 유리병을 입력하고 부드럽게 솔루션에만 microsphere, 그리고 마분지 주택을 커버한다는 돌보는 솔루션에 유리 슬라이드를 밀어. 알루미늄 포일로 병을 커버, 그리고 이전처럼 5도 5 rpm으로 설정 틸트 트레이에 병을 놓습니다. </li><li> 부드럽게 유리병에서 유리 슬라이드를 제거하고 부드럽게 DDI H 2 O로 가득한 알루미늄 포일로 덮여 다른 유리병으로 밀어. 이전과 동일한 속도와 기울기 각도에서 또 다른 10 분 틸트 트레이에 병을 놓습니다. 신선한 물로 두 번 할 때마다이 단계를 반복합니다. 이것은 표면에서 여분의 염료를 제거하는 데 도움이됩니다. </li><li> 부드럽게 이미징 전에 10 분 80 C에서 설정 오븐에서 약병에서 유리 슬라이드를 제거하고 건조. </li></ol> 7. 비오틴 - 종료 실리카의 형광 라벨링 <ol><li> 인산염의 텍사스 - 레드 아비딘 중 10 μg / ML 솔루션을 준비는 염분 버퍼. </li><li> 힌지 캡과 함께 60 ML의 폴리 프로필렌의 유리병에 솔루션을 추가하고 부드럽게 microsphere 방금 솔루션이 적용되어 있도록 솔루션으로 비오틴 - 종료 microsphere를 포함하는 유리 슬라이드를 밀어. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 30 분간 반응. </li><li> 이를 통해 초과 형광단 제거, 10 분 린스PBS 버퍼에 microspheres의의. <ol><li> 이전으로 버퍼와 힌지 캡과 함께 60 ML의 폴리 프로필렌의 유리병을 입력하고 부드럽게 솔루션에만 microsphere, 그리고 마분지 주택을 커버한다는 돌보는 솔루션에 유리 슬라이드를 밀어. </li><li> 알루미늄 포일로 병을 커버, 그리고 이전처럼 5도 5 rpm으로 설정 틸트 트레이에 병을 놓습니다. </li></ol></li><li> 부드럽게 유리병에서 유리 슬라이드를 제거하고 부드럽게 DDI H 2 O로 가득한 알루미늄 포일로 덮여 다른 유리병으로 밀어. 이전과 동일한 속도와 기울기 각도에서 또 다른 10 분 틸트 트레이에 병을 놓습니다. 신선한 물로 두 번 할 때마다이 단계를 반복합니다. 이것은 표면에서 여분의 염료를 제거하는 데 도움이됩니다. </li><li> 부드럽게 80에서 설정된 오븐 ° C 이미징 전에 10 분 안에 유리병에서 유리 슬라이드를 제거하고 건조. </li></ol> 8. 대표 결과 올바르게 기능화 microsphere들 광학 및 형광 현미경을 통해 확인할 수 있습니다. 표면 작용화이 올바르게 완료되면, 그것은 표면에 비오틴 분자의 균일 치밀한 취재 결과를해야하며 표면은 남아 결함 및 오염 물질이없는 작용화 후 검출 실험을하는 동안 그들의 높은 감성을 유지하기 위해. 광학 현미경은 형광 현미경은 표면 범위의 품질과 균일을 알아내기 수있는 반면, 후자를 알아내기 위해 사용될 수 있습니다. 그림 2에서 우리는 제대로 기능화 microspheres의 예를 보여줍니다. 이러한 이미지는 microspheres는 표면에 아민 그룹 (그림 2B) 또는 비오틴 그룹 (그림 2C) 중 하나의 유니폼, 일관된 커버 리지를 표시한다는 표면 손상 또는 작용화 (그림 2A)에 의한 오염이 없다는 것을 표시하고, . microspheres가 올바르게 기능화되지 않은 경우, 광학 microsphere 이미지 WI표면 오염, clumping 또는 비 균일한 커버 리지 및 표면 크랙과 같은 표면에 명백한 결함을, (그림 3) 전시하겠습니다. 여기서는 표면에 시약의 clumping으로 인한 표면 오염 물질의 일반적인 예제를 참조하십시오. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig1.jpg" /> 그림 1. 실리카 microspheres의 표면에 프로브 분자를 부착 3 단계의 반응 방식. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3866/3866fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig2.jpg" /> 그림 2. 실리카 microspheres. 실리카 microsphere의) 광학 현미경은 산소 플라즈마에 노출을 통해 히드록실 그룹과 인구, b)는 실리카 microsphere의 형광 현미경은 일차 아민으로 채워집와 FITC 염료로 분류, 실리카 MI의 C) 형광 현미경crosphere은 비오틴으로 채워집 텍사스 레드 - 아비딘 켤레축으로 표시. Soteropulos의 허가 재판, CE, 헌트, 홍콩 및 알마니는 속삭이는 갤러리 모드 microcavities를 사용하여 바인딩 속도론의 결정 오전. Appl 있습니다. Phys. 레트 사람. 99 103703-103703 (2011). 저작권 2011, 물리학의 미국 학회. 17 <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig3.jpg" /> 그림 3. 부적절 기능화 영역의 광학 현미경. 여기에서 오른쪽 상단 표면에 먼지를 볼뿐만 아니라 오염 표면을 연장하실 수 있습니다. 또한, 광학 microsphere의 오른쪽 측면 표면에 작은 잔디를 보여줍니다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

프로토콜에 설명한 바와 같이, 우리가하는 작용화 과정 내내 자신의 줄기에 의해 실리카 microspheres의 수송을 주택 플랫폼을 만들었습니다. 이 주택 플랫폼 작용화 과정 전반에 걸쳐 사용되는 각종 용기의 벽면과 접촉으로 오는 microsphere에서 발생한 표면 오염 및 손상에 대한 솔루션으로 만들었습니다. 우리는 끊임없이 작용화 과정에서 다른 컨테이너로 개별 microspheres를 장착하고 분리에서 발생한 주요 어려움을 깨달았다. 그것은 줄기에 집중하여 핀셋으로 각각 개별적으로 이동할 때 개체에 대한 microsphere를 솔질을 방지하기 어려웠습니다. 유리 슬라이드의 각 microsphere의 위치를​​ 안정화함으로써, 우리는 microsphere의 줄기 단순히 유리 슬라이드를 처리하여 다양한 컨테이​​너에서 퇴원 microspheres의 번호를 이동할 수 있었다합니다. 이러한 방법으로 우리는 이러한 dev에 많은 functionalize 수 있었다동시에 얼음은, 우리는 피해가, 작용 microspheres를 만드는...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> 어부 </td><td> 67-56-1 </td><td> ACS 학년 </td></tr><tr><td> 황산 </td><td> 어부 </td><td> 8014-95-7 </td><td> 발연 </td></tr><tr><td> 과산화수소 </td><td> 어부 </td><td> 7722-84-1 </td><td> 30 wt %의 </td></tr><tr><td> Aminopropyltrimethoxysilane </td><td> 어부 </td><td> 13822-56-5 </td><td></td></tr><tr><td> 보건국-비오틴 EZ의 링커 </td><td> 찌르다 </td><td> 20,217 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> 어부 </td><td> 67-68-5 </td><td> 무수의 </td></tr><tr><td> 플루오레신 Isothiocyanate </td><td> 찌르다 </td><td> 46,425 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 염분 버퍼 </td><td> 어부 </td><td> 7647-14-5 </td><td> 분말 농축 </td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 버퍼 </td><td> 어부 </td><td> NC0099321 </td><td></td></tr><tr><td> 텍사스 레드 - 아비딘 결합하다 </td><td> 찌르다 </td><td> A820 </td><td></td></tr><tr><td> 광섬유 </td><td> 뉴 포트 </td><td> F-SC </td><td></td></tr><tr><td> 섬유 스트리퍼 </td><td> 섬유 악기 판매 </td><td> NN-175 </td><td> 노 닉 175 음 스트리퍼 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> 어부 </td><td> 06666A </td><td></td></tr><tr><td> 베어 섬유 클리버 </td><td> Ilsintech </td><td> CL-03A </td><td></td></tr><tr><td> 유리 현미경 슬라이드 </td><td> 어부 </td><td> 12-550B </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 프로필렌 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 03-341-75A </td><td> 60 ML, 힌지 캡 </td></tr><tr><td> 로커를 잠복기 </td><td&gt; VWR </td><td> 12620-910 </td><td></td></tr><tr><td> 진공 건조기 </td><td> 어부 </td><td> 08-594-15B </td><td></td></tr></tbody></table>

실란 커플링 에이전트를 사용하여 실리카 광 biosensors에 생물 학적 프로브를 부착

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

이러한 인기 Biacore 시스템 (표면 Plasmon 공명 (SPR) 기술을 기반으로)와 같은 생물 학적 환경, 바이오 센서 플랫폼과 인터페이스하기 위해, 예를 들면, 표면 오염을 방지 수있는 다양한 표면 변형 기법 사용을 만들 조정 소수성 / 표면의 친수성, 전자 환경의 다양한 적응, 그리고 자주, 관심의 대상으로 특이성을 유도. 1-5 이러한 기법 등, 복잡한 환경에서 실제 응용 프로그램에 달리 매우 민감한 biosensors의 기능을 확장할 수 혈액, 소변, 폐수 분석. 2,6-7은 같은 Biacore와 같은 상업 biosensing 플랫폼, 잘 이해하고 있지만로서, 이러한 표면 개조를 수행하기위한 표준 기술은 이러한 기술은 다른 표준화된 방식으로 번역되지 않은 레이블 - 이러한 갤러리 모드 (WGM) 광학 resonators 글린 등 무료 biosensing 플랫폼. 8-9은 &lt;<html> / P&gt; WGM 광학 resonators는 초저 농도의 종 다양한 라벨 프리 검출을 수행하기위한 유망한 기술을 대표하는 6,10-12 이러한 플랫폼의 높은 감도 자신의 독특한 기하학적 광학의 결과입니다. WGM 광학 resonators 경계가 순환 . 구체적이고 필수적인 공진 주파수의 빛을 SPR 플랫폼처럼 13, 광학 필드가 완전히 센서 장치에 국한되지 않지만 evanesces;이 &quot;사라져가는 꼬리&quot;는 다음 주변 환경의 수종과 상호 작용할 수 있습니다. 이러한 상호 작용은 약간 그 결과 변경하는 광학 분야의 효과적인 굴절률을 초래하지만, 감지, 장치의 공진 주파수로 이동합니다. 광학 필드 순환 때문에 신호의 고유 증폭 그 결과 환경을 여러 번 상호 작용, 그리고 환경의 사소한 변화에 매우 높은 감성. 2,14-15 십t &quot;&gt; WGM 광학 resonators는 여러 가지 형상으로 가공 수 있지만 복잡한 환경에서 타겟으로 탐지를 수행하려면 다음 플랫폼은 표면의 수정을 통해 프로브 분자 (결합 쌍 보통 절반, 예를 들어 항체 / 항원) 2.와 결합해야부터 재료 시스템의 다양한 실리카 microsphere는 가장 일반적입니다.이 microspheres은 일반적으로 microspheres가 작용화 및 검출 실험을하는 동안 처리할 수있는가 &quot;줄기&quot;를 제공하는 광섬유의 끝단에 가공하고 있습니다. 실리카 표면 화학 수 있습니다 그들의 표면에 프로브 분자를 장착 적용할 수 있지만, 평면 기판에 대해 생성된 전통적인 기법이 입체 구조를 위해 종종 충분하지 않습니다로서 microspheres의 표면에 어떠한 변경 사항 (먼지, 오염, 표면 결함, 그리고 고르지 코팅) 그들의 검출 능력에 대한 심각한, 부정적인 결과를 가질 수 있습니다. 여기서는 손쉬운 접근 방식을 보여주는실리카 표면에 비오틴을 첨부하여, 무기 표면 및 생물 학적 환경을 해소하기 위해 실란 커플링 에이전트를 사용하여 실리카 microsphere WGM 광학 resonators의 표면 작용화입니다. 8,16 우리가이 리포트에서 센서 시스템으로 실리카 microsphere의 WGM의 resonators를 사용하지만, 프로토콜은 일반적이며, 비오틴과 함께 모든 실리카 장치의 표면을 functionalize하는 데 사용할 수 있습니다.

Biosensors은 복잡한 생물 학적 환경과 인터페이스 및 표면 변형을 통해 센서에 부착된 매우 구체적인 프로브와 고감도 센서를 결합하여 타겟 검색을 수행합니다. 여기서는 센서 및 생물 학적 환경을 해소하기 위해 실란 커플링 에이전트를 이용하여 비오틴과 실리카 광 센서의 표면 작용화를 보여줍니다.

실란 커플링 에이전트를 사용하여 실리카 광 Biosensors에 생물 학적 프로브를 부착

생물학적 환경과 상호작용하기 위해, 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR)에 기반한 널리 쓰이는 Biacore 시스템과 같은 바이오센서 플랫폼은...

본 절차의 전반적인 목표는 장치의 감도를 저하시키지 않으면서 공유 결합 공정을 통해 실리카 마이크로스피어 광 공진기 표면을 비오틴으로 코팅하는 것입니다. 이는 세 단계의 공정으로 수행되며, 우선 산소 플라즈마 또는 Piha etch를 이용한 하이드록실화를 진행하고, 이어서 증착법을 통해 SLAN 커플링 제제를 증착시킵니다. 마지막으로 NHS 에스테르 화학법을 사용하여 비오틴의 발레릭 곁사슬을 공진기 표면의 일차 아민에 연결함으로써 비오틴 코팅을 완료합니다.결과적으로, 이 방법은 표적 분자에 대해 높은 민감도와 특이성을 모두 갖춘 광학 바이오센서를 제작하며, 말단 기능화된 실리카의 형광 표지뿐만 아니라 Ava tin 비오틴 복합체 형성 방법을 통해 더욱 수정함으로써 광범위한 잠재적 표적을 위한 바이오센서 플랫폼을 구축할 수 있습니다. 물리적 흡착과 같은 기존의 표면 기능화 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 프로브 분자가 공유 결합으로 부착된다는 점이며, 이는 센서의 견고함과 신뢰성을 높여줍니다. 즉, 센서를 더 오랜 기간 저장해도 성능이 유지되며, 기능화 이후에도 높은 민감도를 유지할 수 있음을 의미합니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 기능화 과정 전반에 걸쳐 마이크로 크기의 소자를 다루는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 미숙한 취급 기술은 센서의 광학적 성능을 저하시키고 가위 사용 시 센서 표면에 오염을 유발하는 가장 쉬운 원인이 됩니다. 가위를 사용하여 1/4인치 두께의 판지를 1인치 x 1인치 크기의 정사각형으로 자릅니다.이를 표준 유리 슬라이드 위에 테이프로 고정하고, 말아놓은 스카치테이프 1인치 섹션을 카드보드에 부착합니다. 이렇게 하면 마이크로스피어를 주변 환경으로부터 들어 올려 격리할 수 있는 플랫폼이 생성되며, 가위를 사용할 때 표면이 손상되는 것을 방지할 수 있습니다. 스풀에서 광섬유 3인치 섹션을 절단합니다.다음으로, 노닉 파이버 스트리퍼(no nick fiber stripper)를 사용하여 절단된 광섬유 끝단의 마지막 0.5인치 부분에서 보호 폴리머 코팅을 제거하여 실리카 코어만 남깁니다. 메탄올을 적신 킴와이프로 표면에 남은 폴리머를 부드럽게 닦아내어 세척하고, 베어 파이버 클리버(bare fiber cleaver)를 사용하여 스트리핑된 끝단 부분을 다듬어 약 1mm 정도만 남깁니다. 스트리핑된 광섬유 끝단을 이산화탄소 레이저 경로에 수직으로 세심하게

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 문서에서는 우리가 자동 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 표면에 고정화 각 DNA 분자의 흔적을 걱정 얻는 방법에 대해 설명합니다.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다.

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

급속한 균 검출 용 라벨없는 광 바이오 센서가 도입된다. 바이오 센서의 표면에 직접 표적 균 세포를 포착하기 위해 디자인 된 나노 다공성 실리콘에 기반하고있다. 우리는 포획 프로브로서, 다공질 변환기에 고정화 된 모노클로 날 항체를 사용한다. 우리의 연구는 (같은 세포 용해와 같은) 더 이전의 샘플 처리와 분 이내에 낮은 세균 농도의 검출에 대해 이러한 바이오 센서의 적용 가능성을 보여줍니다.

의 광학 검출 E. 대장균 박테리아

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

우리는 폴리실리콘 나노와이어 전계 효과 트랜지스터를 사용하여 장치 준비, 나노와이어 표면에서 DNA 분자 프로브의 고정 및 확인, DNA 감지 조건을 포함하여 생체 감지를 위한 주요 단계를 설명합니다.

화학 및 바이오 센싱 애플리케이션을위한 실리콘 나노 와이어 전계 효과 트랜지스터의 제조

여기서 우리는 원 자간 력 현미경 (AFM)을 사용하여 단일 분자 힘 분광법 측정에 의해 잘 정의 된 무기 표면 중 펩티드 또는 아미노산의 상호 작용의 힘을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다. 측정으로부터 얻어진 정보는 더 펩타이드 무기물 계면을 이해하는 것이 중요하다.

단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력

여기, 우리는 bioinspired 실리 카 재료를 합성 하 고 거기에 효소를 무력화 하는 프로토콜을 제시. 실리 카는 규 산 나트륨 및 '첨가제'는 아민 제어 속도로 중화 결합 하 여 합성 됩니다. 제자리에서 효소 동원 정지 또는 캡슐화 된 첨가제의 합성 후 산 차입 하 여 물성 및 기능을 변경할 수 있습니다.

Bioinspired 메서드를 사용 하 여 기능성 실리 카의 준비

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

여기서 제시된 것은 HJ 분해능을 연구하기 위해 단일 분자 Förster 공명 에너지 전달을 수행하기 위한 프로토콜이다. 2색 교대 여기는 해리 상수를 결정하는 데 사용됩니다. 단색 시간 경과 smFRET는 HJ 분해 전에 거주 시간 분포를 얻기 위해 실시간 절단 분석에 적용된다.

GEN1에 의한 홀리데이 정션 분해능의 실시간 조사를 위한 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 방법

원자력 현미경 검사법 (AFM) 캔틸레버 팁에 프로브 분자의 공유 부착은 물리적 특성의 조사를위한 필수적인 기술입니다. 이를 통해 높은 재현성을 가진 AFM 기반 단일 분자 힘 분광학을 통해 연신력, 탈착력 및 폴리머 길이를 결정할 수 있습니다.

AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

이 작업은 아미네이트 화합물을 실리카 기판에 함침 또는 접목하기 위한 표준화된 기술의 개발을 촉진하는 것을 목표로 하며, 이는 종종 문헌에 광범위하게 설명되어 있습니다. 용매, 기질, 아민의 특정 양 및 기타 중요한 실험 매개변수의 값이 자세히 논의될 것입니다.

탄소 포집을 위한 함침 및 접목된 아민 기반 실리카 복합재를 제조하기 위한 합성 방법론

배우세요 실란 커플링 에이전트를 이용한 실리카 광학 공명기 표면의 바이오틴 공유 결합 부착 방법입니다. 산소 플라즈마 또는 피라나 에칭으로 수산기화한 후 NHS 에스터 화학으로 바이오틴을 결합하여 고감도 광학 바이오센서를 제작합니다.

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