Иммуногистохимического окрашивания B7-H1 (PD-L1) на Парафиновые Слайды из ткани поджелудочной железы аденокарцинома

Общая цель данной процедуры заключается в использовании методов иммуногистохимического окрашивания для оценки экспрессии B, 7, H, 1, PD, Lone на парафиновых срезах ткани аденокарциномы поджелудочной железы человека. Это достигается путем предварительного удаления парафина из срезанных участков ткани и их регидратации. Вторым этапом процедуры является забор антигена, который включает в себя использование скороварки для окрашивания тканей.

За процедурой окрашивания антител следуют этапы усиления сигнала и развития цвета DAB. Заключительными шагами являются обезвоживание и вправление тканей. После завершения.

С помощью микроскопии и анализа изображений можно визуализировать мембранозные и цитоплазматические B seven H one. Этот вопрос может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении эндокарциномы поджелудочной железы, дав нам лучшее понимание того, как B 7 One BTL one способствует подавлению противоопухолевого иммунитета в микроокружении опухоли. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как окрашивание на криосрезах, заключается в том, что он был оптимизирован для использования срезов тканей, залитых парафином, которые часто более доступны и легче хранятся.

Надежное окрашивание антителами на предметных стеклах невозможно без предварительного удаления парафина. Итак, чтобы подготовить горки с засаженными парафином салфетками, сначала запекайте горки при температуре 55 градусов Цельсия в течение 20 минут. Далее в химической вытяжке с помощью серии из семи химических ванн удаляют парафин, сначала погружают предметные стекла в ксилол на 10 минут.

Далее погрузите горки во вторую ванну со свежим ксилолом на 10 минут. В-третьих, погрузите горки в 100% этанол на пять минут. В-четвертых, еще раз погрузите горки в свежий, 100% этанол на пять минут.

В-пятых, погрузите горки в 95% этанол на пять минут. В-шестых, погрузите предметные стекла в 80% этанол на пять минут. Наконец, промойте горки деионизированной водой в течение пяти минут.

После того, как парафин был удален, необходимо сделать антиген доступным. Сначала погрузите слайды в буфер Tris EDTA. Теперь нагрейте горки в скороварке по двухступенчатой программе.

Сначала нагрейте их до 125 градусов Цельсия в течение 30 секунд. Во-вторых, 90 градусов по Цельсию в течение 10 секунд. Затем отставьте горки в сторону, чтобы они остыли до комнатной температуры.

Дав горкам остыть в течение часа, промойте горки TBST дважды, по пять минут на ванну. Теперь слайды можно окрашивать на каждый слайд. Начните с того, что промокните высушивающим раствором TBST вокруг ткани, а затем разметьте круг вокруг ткани гидрофобной ручкой.

На протяжении всей этой процедуры избегайте пересыхания ткани, храня предметные стекла во увлажненной камере. Когда вы не купаетесь, поместите одну каплю блока пероксидазы в гидрофобный круг на предметном стекле. Подождите пять минут и смойте пероксидазу с помощью TBST.

Затем окуните горки в TBST в течение пяти минут. Достаньте предметные стекла из раствора и аккуратно стряхните излишки ТБСТ. Теперь поместите по одной капле блокирующего буфера CE на каждое предметное стекло и инкубируйте их при комнатной температуре в течение 15 минут.

Очистите слайды с помощью ополаскивателя и пятиминутной ванны в TBST. Далее нанесите по одной капле раствора Видана на каждую горку и подождите 15 минут. Снимите АВАДОН с тем же TBST, промойте и искупайте в одном режиме.

Теперь примените биотин. Подождите пять минут и снова очистите слайды с помощью TBST. Теперь инкубируйте предметные стекла с разведением мышиного моноклонального антитела или контрольного антитела.

При ТБСТ позволяют любому антителу конъюгироваться при четырех градусах Цельсия в течение 22 часов. На следующий день вымойте горки с TBST три раза, как и раньше. Каждое мытье включает в себя ополаскивание A-T-B-S-T и пятиминутную ванну.

Этот режим тройной промывки повторяется несколько раз в дальнейшем при смывании первичного антитела. Приготовьте комплексный раствор STR titin Bio ITIN. Его следует готовить не менее чем за 30 минут до использования.

Теперь инкубируйте предметные стекла с биотином, конъюгированным с козьим вторичным антителом к УЗИ в растворе козьей сыворотки в течение 30 минут. Во время этой инкубации следуйте инструкциям набора DACO, чтобы приготовить раствор субстрата DAB CHROMOGEN. Раствор можно хранить при температуре четыре градуса в темноте до восьми часов.

После инкубации проведите TBST тройную промывку. Далее поместите одну каплю стриппина биотинового комплекса. На каждой горке инкубируйте слайды в течение 15 минут, а затем трижды промойте слайды TBST.

Далее нанесите каплю реактива для усиления на каждое предметное стекло. Подождите четыре минуты и трижды промойте горки TBST. После того как реактив для амплификации будет смыт, добавьте каплю стрептавидина HRP в каждое предметное стекло и инкубируйте их в течение 15 минут.

Проведите еще одну тройную промывку TBST, прежде чем продолжить. Теперь наступает самый чувствительный этап процедуры. Добавьте одну каплю DAB подложки CHROMOGEN с субстратом перекисью водорода на предметное стекло и начните наблюдать за развитием цвета, The DAB substrate.

Время проявления CHROMOGEN обычно составляет две минуты, но мы регулярно контролируем проявление под микроскопом, чтобы обеспечить оптимальное окрашивание. С минимальным фоном для каждого раунда окрашивания, мы включаем один предметный предмет из предыдущей партии и один предметный предмет миндалин в качестве положительного контроля. Когда все будет готово, немедленно промойте горку в воде, а не в TBST.

Инкубируйте предметное стекло с одной каплей гематина в течение 90 секунд. Немедленно промойте предметное стекло дистиллированной деионизированной водой, затем мыльной водой из-под крана, а затем еще водой DD. На этом процедура окрашивания завершена.

После того, как все предметные стекла будут окрашены, используйте серию этанола для обезвоживания предметных стекол перед их установкой. Первый. Погрузите предметные стекла в 80% этанол на три минуты. Во-вторых, погрузите предметные стекла в 95% этанол на три минуты.

Для третьей и четвертой ванн погрузите горки в 100% этанол на пять минут. Пятое и шестое, погрузите горки в ксилол на пять минут. Наконец, добавьте по одной капле на каждую горку и аккуратно нанесите защитный лист.

В настоящее время слайды готовы к микроскопии: иммуногистохимическое окрашивание с использованием B seven H one продемонстрировало гетерогенную экспрессию B seven H one при аденокарциноме поджелудочной железы. Они воспринимаются как коричневые с развитием цвета DAB. Некоторые клетки аденокарциномы поджелудочной железы имеют преимущественно мембранозную экспрессию B seven H one, в то время как другие имеют либо преимущественно цитоплазматическую экспрессию B seven H one, либо малую экспрессию B seven H одного нормального эпителия протока поджелудочной железы экспрессируется немного B семь H один окрашивание мышиным антителом IgG один каппа контролируют вместо антитела против B семь H one производят очень небольшое фоновое окрашивание После освоения этот метод может быть выполнен за семь часов, распределен на два дня с 22-часовой ночной инкубацией, если она выполнена правильно после этого развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области онкологии к изучению сигналов B 7 H one PD L one при других злокачественных новообразованиях.