小胶质细胞的小分子RNA检测在正常中枢神经系统的实时PCR技术在神经发炎

该程序的总体目标是分析小胶质细胞中 micro RNA 的表达。这是通过首先解剖大脑和脊髓，然后对中枢神经系统或 CNS 组织进行均质化来实现的。在第二步中，通过每次调用梯度分离来自 CNS 的单核细胞，然后通过事实鉴定小胶质细胞群。

接下来，分离小胶质细胞 RNA 并分析样品的质量。最后，对感兴趣的特定 micro RNA 进行实时 PCR。最终，delta delta CT 方法可用于显示小胶质细胞中特定 micro RNA 的相对表达水平。

一般来说，刚接触这种方法的个体会很挣扎，因为他们无法从 CNS 中分离出足够数量的单核细胞，或者因为样品被污染，髓鞘和细胞碎片。两种情况都会导致制备质量低，但分别是 RNA 浓度低或蛋白质污染。演示该程序的是 me 和 vir。

Dr.O fellow 来自 灌注所有小鼠后，解剖大脑和脊髓。然后一次将一个大脑和一个脊髓放入 15 毫升唐氏匀浆器中，每次向组织中加入 5 毫升 PBS。轻轻敲击 10 到 20 次后，将均匀的 70 微米细胞过滤器放入单独的 50 毫升锥形管中，并在 834 倍 G 和 4 摄氏度下离心管 5 到 7 分钟。

丢弃上清液后，Resus 将大脑和脊髓均匀地从 2 到 3 只小鼠悬浮在 5 到 7 毫升中，每次调用 70%。然后覆盖 7 毫升 40% 的每次通话，并将每次通话和电池溶液在 850 倍 G 20 摄氏度下旋转 30 分钟，不间断。丢弃损坏的细胞，并在每次通话 70% 的顶部丢弃 mile 和碎屑。

然后在每次调用溶液 70% 和 40% 之间的界面处收集单核细胞，并在 PBS 中稀释收集的细胞，至少以一比一的比例稀释。离心细胞后，将沉淀放入半毫升 PBS 中，并将其转移到 1.7 毫升 einor 管中。首先将 50 μL 密度梯度分选的细胞转移到新的 1.7 mL浓度管中，并向管中加入 350 μL 传真缓冲液。

然后，在向试管中加入 5 至 10 微升抗 FCR 抗体后，将细胞在冰上孵育 10 至 15 分钟。将细胞样品分成两个 einor管加入 1 μL 抗 CD 11 B 和 2 μL 抗 CD 45 抗体。

将细胞在冰上再孵育 10 到 15 分钟。标记第二管阴性对照并将其置于冰上。与染色抗体孵育后，向两个试管中加入 1 mL 传真缓冲液，并在微量离心机中以 1200 次离心离心 5 分钟。

G.然后将沉淀固定在 400 微升 1% 对甲醛的 PBS 溶液中，并涡旋试管以防止结块。最后，使用阴性对照细胞样品通过流式细胞术分析细胞，BD com 珠首先皮下免疫一组 5 至 10 只 8 至 12 周龄的 C 57 黑色六只小鼠，在每毫升 4 毫克完全叶子佐剂中加入 150 毫克 MOG 35 至 55 肽以诱导 EAE。然后在免疫接种后第 0 天和第 2 天腹膜内施用百日咳毒素。

按照刚才所示的复苏对细胞进行分离和染色后，在分选前将沉淀悬浮在 400 微升 PBS 中，而不是固定剂中。然后用 300 微升 PBS 填充两个 1.7 毫升的 einor 管，并补充 10% FBS 以收集样品。最后，使用这个代表性密度图中所示的门控策略将小胶质细胞和巨噬细胞群分类至高纯度。

分选后，重新分析小胶质细胞和巨噬细胞群，以确定分离细胞样品的纯度。在微量离心机中以 1200 倍 G 离心分选的细胞群 5 至 7 分钟后，小心去除上清液，并将细胞沉淀物冷冻在干冰上。接下来，将冷冻细胞沉淀转移到普通冰中。

对于解冻，从 Nirvana 试剂盒中加入 300 μL 裂解缓冲液，然后通过移液 5 到 7 次轻轻混合细胞溶液。然后加入 30 微升匀浆添加剂，涡旋细胞悬液 30 秒，然后将试管置于冰上 10 分钟。现在加入 300 微升酸性苯酚、氯仿，再涡旋试管 30 秒。

然后，在以 9， 500 x G 的浓度离心细胞 5 分钟后，小心地将含有水相的上清液的上部 300 μL 转移到新的 1.7 mL 规格管中。将溶液与 375 微升 100% 乙醇混合。将整个试管内容物从 Nirvana 试剂盒转移到过滤柱中，并以 9， 500 次 G 旋转柱 1 分钟，然后丢弃流过缓冲液。

加入 700 微升洗涤液（来自 Nirvana 试剂盒中的一种），并在洗涤小柱后以 9， 500 倍 G 的速度再旋转一分钟。用 500 μL 洗涤液再注射 2 次。两个来自 Nirvana 试剂盒洗脱，来自小柱的 RNA，用 60 μL 预热的无核酸酶水。

最后，在进行实时 Q-R-T-P-C-R 检测小胶质细胞和巨噬细胞样品中的微量 RNA 后，使用 NanoDrop 分光光度计评估 RNA 的纯度和数量。可以创建荧光标记的 mere 1、24 和 snow RNA 55 PCR 产物的 P-R-T-P-C-R 曲线，如第一张图所示。显示了从小胶质细胞或骨髓来源的巨噬细胞中分离的对照雪 RNA 55 RNA 样品的荧光标记特异性 PCR 产物量与 PCR 循环次数相比的典型曲线。

请注意如何在基线与 Q-R-T-P-C-R 曲线线性范围的下半部分的交点处确定用于分析来自不同细胞群的雪 RNA 55 表达的 CT 值，如图所示，由绿色和蓝色垂直线表示。在第二张图中，显示了来自 PCR 循环数的实验中来自小胶质细胞或骨髓衍生巨噬细胞的 1 24 个 RNA 样品的荧光标记特异性 PCR 产物的量。请注意，用于分析来自不同细胞群的仅 1 24 个表达的 CT 值是如何在基线与 Q-R-T-P-C-R 曲线线性范围的下部交点处再次确定的，如图所示，由绿色和蓝色垂直线表示。

在确定每个样品的 CT 值后，对于本表所示的正常小鼠和 EAE 小鼠的小胶质细胞和 BM dms 中的雪 RNA 55 和仅 1 24 表达，从实验中仅 1 24 个样品的 CT 值中减去对照雪 RNA 55 样品的 CT 值，以计算每个样品的每个副本的 delta CT 值。然后从其他样品的 delta CT 值中减去参考样品的 delta CT，以计算 delta delta CT 值。最后，将每个样品的相对表达水平计算为负 delta delta CT 的 2 次方，如此密度图所示。

在从正常 CNS 中良好分离小胶质细胞的情况下，95% 至 98% 的细胞将代表 CD 11 B 阳性 CD 45 低小胶质细胞，其中 2% 至 5% 的细胞悬液由 CD 11 B 阳性 CD 45 高血管周围巨噬细胞组成，少于 1% 的 CD 11 B 阴性 CD 45 高淋巴细胞或 CD 11 B 阴性 CD 45 阴性星形胶质细胞或寡 DRO 神经胶质细胞或者细胞碎片将相对地存在于不良制备中。CD 11 B、阴性 CD 45 阴性细胞或细胞片段（如星形胶质细胞或髓鞘颗粒）受到严重污染，使细胞不适合 RNA 分离和进一步分析。此外，也可能存在 CD 11 B 阴性 CD 45 高细胞，表明由于灌注不足而受到血淋巴细胞污染在该密度图中，神经炎症期间存在于 CNS 中的三个细胞群 CD 11 B 阳性 CD 45、低小胶质细胞 CD 11 B 阳性 CD 45 高巨噬细胞和 CD 11 B 阴性 CD 45 高淋巴细胞如图所示。

显示了分离良好与不良分离后通过凝胶电泳确定的 RNA 质量。当以干净的方式分离 RNA 时，当分离过程执行不良时，RNA 分子量标准和核糖体 RNA 很明显，弥散条带和低分子量降解产物很明显。这些最终数据表明，在具有 EAE 的小鼠的正常成年小胶质细胞小胶质细胞和发育早期从小鼠中分离的小胶质细胞中，仅表达 1 24 个。

在第一个条形图中，与在骨髓衍生的巨噬细胞中观察到的相比，正常 CNS 的小胶质细胞中仅 1 24 的相对表达要大得多。同样，尽管 EAE 小胶质细胞小鼠的 CNS 巨噬细胞中仅增加了 1 24 个 RNA，但其表达量仍然是仅 1 24 个 RNA 的五倍。最后的条形图展示了与成年 8 周龄小鼠相比，在 1 周、2 周和 4 周龄的小鼠发育过程中，小胶质细胞中仅 1 24 的表达水平的变化也可以在尝试该程序时使用该方法进行评估。

重要的是要记住拥有足够数量和良好的分离细胞质量，这将保证整个实验的良好结果。