一种改进的EPA方法1623使用切向流中空纤维超滤和热解离步骤检测水性隐和贾第虫属。

该程序的总体目标是检测和可视化水生、隐孢子虫和贾第鞭毛虫物种。这是通过首先使用切向流、中空纤维、超滤浓缩水样来实现的。第二步是在离心步骤后洗脱微生物并捕获过滤器中的碎片。

免疫磁性分离允许从浓缩碎片中选择性分离寄生虫。磁珠通过热解离从寄生虫中分离出来，并使用磁铁去除。然后将囊肿和 O 囊肿放在载玻片上，对样品进行染色，以便通过免疫荧光显微镜观察。

与现有技术相比，hofi 过滤的主要优点是超滤器的成本要低得多，并且除了隐孢子虫和贾第鞭毛虫等病毒和细菌外，还可以捕获多种微生物。一般来说，刚接触免疫分离的个体会受到与来自非常气候条件的不同样品相关的碎片数量和类型的挑战。首先将超滤装置组装在生物安全柜内。

组装完成后，设备功能如下，水样通过黑色 T 型连接器进入系统，并通过泵头、压力表进入中空纤维超滤器，过滤后的水从过滤器侧面进入废物容器。含有生物体的残留水被压入 retent tape 瓶中，并在系统中再循环，直到水量减少。要开始该程序，请取下通气帽并打开除夹钳 2 之外的所有夹子，夹钳 2 应关闭以使储液瓶装满水，设置泵方向，使水样流入过滤器。

然后将泵速调整到 25%，并在 renate 瓶三分之二完全打开时打开泵。捏住夹子 2 个，并使用通气帽快速密封瓶子。检查所有管路和配件，确保没有泄漏。

然后使用量筒和计时器或流量计缓慢将泵速提高到每分钟 1.5 升左右，验证滤液速率（从出水管流出的水的速率）确实是每分钟 1.5 升。监控过滤过程，确保 reten 瓶永远不会排空，尽管体积可能会略有增加或减少。如果体积降至 1/3 以下，请取下通气帽并关闭 2 号夹钳。

同样，让瓶子中的体积增加到三分之二。然后盖紧通气帽并再次打开夹子 2。样品容器清空后，关闭夹钳 1 立即将泵速降低至 20%取下储液瓶的通气盖，并关闭将过滤柱流出管连接到废液罐的斜道夹。

拧紧或松开斜道夹，将 retent ate 瓶中的容量调整至约 200 毫升。然后拧紧 Elucian 的斜坡夹以洗脱样品。首先，向样品容器中加入 500 毫升 Elucian 溶液，在此过程中冲洗容器内部。

然后将连接到样品摄取管路的 10 毫升移液器放入 Elucian 溶液容器中。暂时打开捏夹 1 和关闭捏夹 2 以吸取 Elucian 溶液。加载完所有溶液后，合上捏夹 1，打开捏夹 2，让溶液以 20% 的泵速循环 5 分钟拧紧或松开斜道夹，将 renate 瓶中的样品体积调节至约 100 mL。

然后完全拧紧 Ramp 夹具，让样品再循环 1 分钟。此时，将泵的方向反转 20 秒。这将导致 tate 瓶中积累约 225 毫升样品。

然后关闭泵。从泵头上拆下管路和从过滤器中流出的管路，将管路放在瓶上，以将剩余的样品压入瓶中。然后断开所有管路与瓶子的连接，并用不通风帽更换放空帽。

将浓缩的样品转移至 250 mL 锥形离心管中。用 10 毫升试剂水冲洗 renate 瓶两次，然后将冲洗液转移到离心管中。以至少 1500 倍 G 的速度离心样品 15 分钟。

不要使用休息来停止离心。离心后，小心地将上清液吸出至沉淀物上方 5 mL。应格外小心保持在液面顶部，避免吸入 O 型囊肿和颗粒内的囊肿。

涡旋试管以彻底重悬沉淀。然后将样品转移至平边 dyal L 10 管中，其中含有 10 X SL 缓冲液 A 和缓冲液 B，用 2.5 ml 试剂水冲洗离心管两次，并将冲洗液添加到 dyal L 10 管中。将最终体积调至 12 mL，向试管中加入磁珠偶联抗体、抗隐孢子虫抗体和抗贾第鞭毛虫抗体各 100 μL。

然后在旋转后在旋转的混合器上在室温下以 18 RPM 的速度旋转试管 1 小时。将试管的平坦面靠在 MP six 磁铁上，轻轻摇动试管 2 分钟，不要将试管从磁铁上取下。保持平坦的一面朝上，倒出上清液。

小心不要打扰保留在磁体附近管子平坦侧的磁珠。从磁铁上取下样品管，用 500 微升缓冲液 A 冲洗管的平坦面 3 次，避免管子圆形侧的碎屑。将每个冲洗体积转移到 MPCS 磁铁内的 1.5 mL 微量离心管中。

磁铁处于垂直位置。关闭管子并轻轻摇晃 1 分钟。然后，将磁铁固定到位，使用位于试管底部的牧场移液管吸出上清液，向试管中轻轻加入 1 毫升 PBS。

注意不要打扰珠子沉淀。连接到与磁体相邻的管壁上。取下磁条并轻轻摇动试管，直到珠子重新悬浮。

将磁条重新插入垂直位置。轻轻摇动试管一分钟，然后吸出上清液，在不干扰珠子的情况下去除尽可能多的碎屑。洗涤后，取下磁铁，将 50 μL 试剂水直接加入到微珠调色板中。

速涡旋试管 50 秒以重悬磁珠。然后将样品在 80 摄氏度下孵育 10 分钟，让贾第鞭毛虫包囊和隐孢子虫 o 包囊从珠子上解离孵育后，将样品涡旋 30 秒。然后使用倾斜位置将磁条放入 MPCS 中，以将磁珠与悬浮的囊肿和 O 囊肿分开。

将含有囊肿和 O 囊肿的上清液转移到孔载玻片上。重复加水涡旋和热解离步骤，再次将上清液加入同一载玻片中。然后将滑块放在 37 摄氏度的滑块加热器上以干燥悬架。

首先在载玻片上涂抹 50 μL 甲醇以固定样品，并使其在室温下干燥。接下来，加入 50 μL DPI 溶液，并在室温下孵育玻片 2 分钟。要给细胞核染色，请使用 Kim 湿巾从井中吸走湿润的污垢，注意不要接触井。

然后加入 50 微升易染色剂，对贾第鞭毛虫包囊和隐孢子虫 o 包囊的细胞壁进行染色。将样品在 35 摄氏度下孵育 30 分钟。像以前一样用 Kim 湿巾去除污渍。

然后小心地将移液器吸头放在孔外，让液体进入孔中，慢慢加入 300 μL 冷易染色固定缓冲液。在室温下孵育玻片 2 分钟。然后用 kim 抹布去除缓冲液，并涂抹 10 微升封固剂 轻轻地将盖玻片放在样品上，去除任何气泡，并用透明指甲油密封盖玻片 使用荧光显微镜，以 200 x 至 1000 x 的放大倍率和 fse 检查载玻片，然后以 200 x 放大倍率检查载玻片 DPI 滤光片 囊肿和 O 囊肿显示为明亮的苹果绿色荧光卵形结构，具有明亮的高亮显示的边缘。

隐孢子虫 O 囊肿是圆形的，大小从 4 到 6 微米不等。贾第鞭毛虫包囊较大，宽度为 5 至 15 微米，长度为 8 至 18 微米，放大倍数为 1000 倍时为圆形或卵形。使用 DPI 过滤器，可以更好地欣赏囊肿和 CYS 的内部结构。

通常，在隐孢子虫 O cys 和贾第鞭毛虫 Cys.DIC 中可以看到多达四个子孢子，它们显示为天蓝色 DPI 染色核。显微镜还有助于正确识别寄生虫，因为可能会欣赏其他形态特征。隐孢子虫子孢子可以通过 DIC 可见贾第鞭毛虫包囊通常表现出一个或多个可辨别的内部结构，例如可见的细胞核、称为正中体的新月形细胞器和称为轴突的内部鞭毛结构。

需要注意的是，全息纤维超滤程序具有捕获多种微生物的能力。此外，其他检测分析方法（如 QPCR 和基因分型）可应用于浓缩样品，这使得该方法更灵活，更适合您的应用。感谢您的观看，如果您有任何问题，请告诉我们。