3-Dimensional Resin Casting und Imaging of Mouse Pfortader oder intrahepatische Gallengang-System

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen dreidimensionalen Abdruck eines Gefäß- oder Duktgewebes zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Zielstruktur, wie z. B. die Pfortader, vorbereitet und kanüliert und die Kanüle festgebunden wird. Als nächstes wird Harz aufbereitet, in die Pfortader injiziert und aushärten gelassen.

Dann wird die Leber entfernt und das Gewebe fixiert oder mazeriert. Zum Schluss wird die Leber gereinigt und die Gipsstruktur sichtbar gemacht. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden.

Die Veränderungen in der Architektur der Gefäß- oder Kanalstruktur durch visuelle Analyse oder Quantifizierung mittels Mikro-CT zeigen. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Leberarchitektur geben. Es kann auch auf das Gefäß- oder Kanalsystem jedes Organs angewendet werden, einschließlich Gehirn, Lunge, Bauchspeicheldrüse und Nieren.

Um die Kanüle mit den Fingerspitzen vorzubereiten, erwärmen Sie ein ein Zentimeter langes Stück PE 10 Schlauch und ziehen Sie vorsichtig daran, so dass es dünn wird. Schneiden Sie den gespannten Schlauch diagonal ab. Um eine abgeschrägte Spitze zu erzeugen, schneiden Sie die andere Kante des Schlauchs ab, um ein Segment von fünf bis sechs Zoll zu erzeugen.

Führen Sie eine 32-Gauge-Injektionsnadel mit einem halben Zoll in den nicht abgeschrägten Rand des Schlauchs ein. Bereiten Sie eine Drei-Milliliter-Spritze vor, indem Sie sie zuerst mit PBS füllen und die Nadel mit dem Schlauch aufschrauben. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze befinden und dass die Nadel mit PBS gefüllt ist, indem Sie die Spritze schnippen und den Kolben drücken.

Wiegen Sie 0,1 Gramm Katalysator in einen kleinen Behälter ab. Ziehe dann einen Milliliter Harz in eine drei Milliliter Spritze. Schneiden Sie zum Schluss ein fünf Zoll langes Stück Seidennaht ab, das als Ligatur verwendet werden soll.

Nachdem du eine erwachsene Maus geopfert hast, lege sie auf den Rücken und öffne die Bauchhöhle. Legen Sie die Maus auf die Plattform eines Präpariermikroskops und positionieren Sie ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen senkrecht unter der Maus, um die Sichtbarkeit und Zugänglichkeit zur Leber zu erhöhen. Befeuchten Sie ein Wattestäbchen mit PBS und drehen Sie die Leber damit nach oben und weg, um die dorsale Ansicht der Leber zusammen mit dem zusätzlichen Leberportal, der Vene oder dem gemeinsamen Gallengang freizulegen.

Bei Pfortaderabdrücken wird die Blutgerinnung verhindert, indem die Vene mit Raumtemperatur gespült wird. PBS befestigt eine Nadel an einer mit PBS gefüllten Drei-Milliliter-Spritze und ist so weit wie möglich von der Leber entfernt. Führen Sie es in die zusätzliche Leberpfortader ein.

Drücken Sie anschließend PBS vorsichtig in die Pfortader. Machen Sie dann einen Schnitt in die Vena cardinal, um das Blut abzulassen, falls erforderlich, um die Blutdrainage zu verbessern, verwenden Sie ein feuchtes Wattestäbchen, um die Leber zu massieren. Wenn Sie mit einem offenen System arbeiten, kann es hilfreich sein, eine Ligatur am anderen Ende des Systems zu binden und festzuziehen.

Wenn die Vena cardinal communis geöffnet wird, um Blut aus der Pfortader abzulassen, binden Sie eine Ligatur um sie herum, um den Druck in der Pfortader zu erhöhen und ein Austreten von Harz in die zentrale Lebervene zu verhindern. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um die chirurgische Nahtligatur etwa einen Viertelzoll von der Leber entfernt unter einer der beiden Strukturen zu führen. Binden Sie die Naht zu einem lockeren gemeinsamen Knoten, ohne sie festzuziehen.

Als nächstes machst du mit einer Federschere einen kleinen Schnitt in die Pfortader oder den Gallengang etwa einen Viertelzoll unterhalb des Nahtknotens. Dieser Schnitt sollte nicht mehr als die Hälfte des Durchmessers einer der beiden Strukturen durchdringen. Halten Sie dann mit einer Pinzette Nummer fünf die Pfortader oder den Gallengang an der Stelle des Schnitts und führen Sie das abgeschrägte Ende des Schlauchs ein.

Schieben Sie die Spitze des Schlauchs an der hübschen Ligatur vorbei in Richtung Leber. Testen Sie die Genauigkeit der Kanülierung, indem Sie PBS durch die Kanüle injizieren und beobachten, ob es in die Pfortader oder den Gallengang gelangt. Ziehen Sie die Ligatur fest, um die Kanüle an Ort und Stelle zu halten.

Geben Sie den vordosierten einen Milliliter Harz zu den vorgemessenen 0,1 Gramm Katalysator und mischen Sie gründlich, um Luftblasen zu vermeiden. Ziehen Sie das Harz-Katalysator-Gemisch zurück in die Drei-Milliliter-Spritze. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie die Spritze vorsichtig schnippen und die Blasen ausstoßen.

Ersetzen Sie die PBS-haltige Spritze vorsichtig durch die harzhaltige Spritze, und lassen Sie die 32-Gauge-Nadel an der Kanüle befestigt. Schieben Sie das Harz langsam und vorsichtig in die Pfortader oder den Gallengang, bis der Widerstand zunimmt und die Leber gefüllt ist. Um eine gleichmäßige Füllung zu fördern.

Verwenden Sie ein feuchtes Wattestäbchen, um die Leber sanft zu massieren, entfernen Sie die Kanüle und ziehen Sie die Ligatur schnell wieder fest, um ein Auslaufen von Harz zu verhindern. Lassen Sie die Maus 20 Minuten lang flach bei Raumtemperatur liegen, während das Harz aushärtet, bevor Sie die Leber entfernen, um die Leber für die Visualisierung von innen zu reinigen, fixieren Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius. Gießen Sie das ab und fügen Sie PBS hinzu.

Waschen Sie die Leber mindestens vier Stunden lang in PBS. Die Leberlappen können an dieser Stelle abgetrennt werden, wenn dies gewünscht wird. Dehydrieren Sie das Gewebe in 50 % Methanol und anschließend in 100 % Methanol für jeweils mindestens vier Stunden.

Schaukeln bei Raumtemperatur. Reinigen Sie die Leber in einer Ein- bis Zweilösung aus Benzoylalkohol und Benzoylbenzoat für mindestens 24 Stunden länger. Für die Bildgebung in situ können Waschzeiten erforderlich sein.

Tauchen Sie die Leber in BABB in eine Petrischale aus Glas, als alternative Methode, um das Gewebe zu mazerieren. Nachdem Sie die Leber aus dem Tier entnommen haben, geben Sie sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit Wasser. Warten Sie eine Stunde, bis das Harz vollständig ausgehärtet ist.

Gießen Sie das Wasser ab und geben Sie die Leber in eine Glasflasche. Tauchen Sie es in 15%iges Kaliumhydroxid und lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur stehen, ohne es vorsichtig zu wiegen. Gießen Sie das Kaliumhydroxid ab und waschen Sie den Guss in destilliertem Wasser.

Vermeiden Sie es, den Gips zu unterbrechen, wenn Sie Flüssigkeit zum Schlauch hinzufügen oder daraus entfernen. Wenn der Harzabguss sauber ist, legen Sie ihn zum Trocknen vorsichtig auf ein Kim-Tuch und geben Sie ihn dann zur Aufbewahrung in einen Behälter. Diese Abbildung zeigt einen Pfortaderguss, wie er in situ nach der BABB-Klärung sichtbar gemacht wurde.

Hier ist der Abdruck des gesamten linken Leberlappens sowie die Form und Größe des Gipses zu sehen. Dies ist eine Nahaufnahme desselben Abgusses, die das Eindringen des Harzes in die kleinsten Pfortaderäste an der Leberperipherie zeigt. Hier wurde ein Pfortaderabguss einer Kaliumhydroxidmazeration unterzogen, wobei hier der gesamte linke Lappen und hier eine Nahaufnahme der kleinen peripheren Äste

Häufige Probleme sind unvollständige Füllungen, Blasen im Harz und ein Überlaufen in umliegende Systeme oder Gewebe. Diese Abbildung zeigt, wie man eine unvollständige Füllung von Blasen und einen Überlauf von Harz von der Pfortader zur Zentralvene erkennt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Harz äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten in einem gut belüfteten Bereich getroffen werden sollten.