Isolamento de fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos, classificando células activadas por fluorescência (FACS)

O objetivo deste procedimento é isolar fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos. Isso é feito dissecando primeiro as glândulas mamárias. O segundo passo é preparar glândulas mamárias, suspensões unicelulares, próxima célula sustentada com anticorpos específicos para fibroblastos, bem como anticorpos específicos para outras populações celulares.

A etapa final é realizar o fornecimento ou fatos de células ativadas por fluorescência. Em última análise, o perfil de expressão Q-R-T-P-C-R de marcadores específicos expressos nas populações de células classificadas é usado para avaliar a pureza das populações de células classificadas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes para isolamento de fibroblastos é que ela permite o isolamento da maioria dos fibroblastos teciduais com contaminação mínima por células imunes ou células epiteliais, evitando uma etapa de cultura de tecidos que possa alterar o perfil de expressão gênica dos fibroblastos.

A implicação dessa técnica se estende a todas as terapias do câncer de mama porque a compreensão e a identificação de alvos moleculares podem fornecer uma nova abordagem Combinator para combater a progressão do câncer de mama, estender a sobrevida do paciente e, finalmente, ajudar a melhorar e adaptar as opções terapêuticas individualizadas. Além do seu olho, apenas a Dra. Lena, o gerente do laboratório demonstrará o procedimento para iniciar este procedimento. Coloque a rata eutanasiada de costas em uma superfície de isopor e use agulhas de calibre 25 para prender firmemente os quatro membros.

Pulverize o camundongo generosamente com etanol 70% usando uma pinça. Puxe a pele abdominal na linha média e faça uma pequena incisão com uma tesoura afiada a partir da incisão. Corte a pele até o pescoço do animal, evitando perfurar as cavidades torácicas abdominais.

Corte a pele das patas traseiras da incisão da linha média em direção à perna, resultando em uma forma de Y. Em seguida, afaste a pele do corpo do camundongo e prenda expondo as glândulas mamárias presas à parte inferior da pele. Uma das coisas mais problemáticas neste procedimento é evitar a retirada de tecido muscular.

Para evitar esse problema, vou pegar apenas a quarta e a quinta glândula mamária e não a segunda, que fica próxima ao tecido muscular. Use cotonetes para separar suavemente a glândula de memória da pele enquanto corta o tecido conjuntivo com uma pequena tesoura afiada para separar a glândula de memória em direção à coluna do camundongo, remova quaisquer regiões necróticas encontradas. Coloque as glândulas de memória dissecadas em PBS no gelo.

A maneira mais fácil de obter tecido cutâneo sem ter que lidar com a depilação é usar orelhas de rato. Use uma tesoura afiada para cortar ambas as orelhas do camundongo sacrificado. Coloque as orelhas imediatamente em um frasco de digestão contendo um pequeno volume de PBS no gelo.

Para preparar uma suspensão de célula única da glândula mamária, use uma tesoura curva para picar completamente as glândulas mamárias em um frasco de digestão contendo um pequeno volume de PBS no gelo, adicione 20 mililitros de solução de colagenase ao tecido picado. Essa quantidade de solução de colagenase dissociará eficientemente aproximadamente cinco gramas de memória ou tecido tumoral e orelhas de até 15 camundongos. Coloque imediatamente em uma placa de agitação em banho-maria a 37 graus Celsius e incube por 15 minutos enquanto mexe a uma taxa média para interromper a reação em 30 mililitros de DMEM frio mais 10% FCS.

Em seguida, coe a mistura de tecido e meio através de um filtro de células de 70 mícrons colocado em cima de um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugue o tubo cônico por cinco minutos a 450 vezes G a quatro graus Celsius. Se os camundongos não foram perfundidos com PBS antes do sacrifício, os glóbulos vermelhos na amostra terão que ser mentiras antes da coloração imunológica.

As células devem ser bloqueadas para FC endógena antes de marcar fibroblastos e outras populações de células. Resus suspende as células em um a três mililitros de tampão de fax um e, em seguida, adiciona o bloco FC em uma diluição de um a 50 incubar no gelo por 10 a 20 minutos. Não há necessidade de lavar as alíquotas de células de 100 microlitros de transferência de bloco FC para tubos de orph para serem usados como um controle não corado e controles de cor única.

Dependendo do número de anticorpos fluorescentes usados nesta demonstração, dois anticorpos fluorescentes serão usados para marcar fibroblastos no receptor alfa anti-PDGF. Isso é conjugado diretamente a um Fluor em uma diluição de um a 50 para a amostra de classificação, bem como os controles de cor única para rotular outras populações de células. Adicione os anticorpos conjugados fluorescentes apropriados aos marcadores de superfície também em uma diluição de um a 50.

Recomenda-se adicionar anticorpos também aos tubos de controle de cor única apropriados, incluindo anticorpos para células imunes e células epiteliais, a fim de excluir quaisquer populações duplamente positivas e, assim, aumentar a pureza dos fibroblastos isolados. Em seguida, incube as células com anticorpos por uma hora no gelo no escuro após uma hora lave as células enchendo os tubos com tampão de fax um e girando por cinco minutos a 450 vezes G a quatro graus Celsius, células de US aspirado e resus dobrado em tampão de fax um até uma concentração mais apropriada para classificação com o classificador de fax a ser usado. Transfira as células marcadas para tubos de fax com tampas de filtro e células de filtro para os tubos para evitar aglomerados de células, caroços para excluir células mortas.

Um DPI para todas as amostras, exceto para o controle não corado. Mantenha as amostras no gelo durante a análise do fax. Para iniciar este procedimento, use o software classificador de fatos para preparar a configuração fluorescente, a configuração de aquisição e a configuração de gota hidrodinâmica.

Vortex cada amostra brevemente para ressuspender as células antes de carregar no classificador de células. Comece analisando a amostra não corada para definir o gating para a população total de células para bloquear os detritos celulares e determinar a autofluorescência ou coloração de fundo. Em seguida, analise a amostra não corada mais DPI para determinar e bloquear a população de células vivas da população total de células.

Analise cada controle de cor para determinar e calibrar parâmetros como compensação. Analise a amostra de mancha para definir a posição dos portões para classificação. Uma vez que os parâmetros e portas para as populações de células desejadas tenham sido definidos, comece a classificar as populações de células marcadas em tubos eph ou tubos cônicos de 15 mililitros contendo meio de cultura ou tampão de lise de RNA.

Imediatamente após o término da classificação, gire as células para baixo e transfira para um meio fresco ou tampão de lise de RNA. Dependendo do objetivo do seu experimento, se classificados, os fibroblastos devem ser cultivados, sempre em placas revestidas de colágeno, nunca diretamente no plástico, pois isso resultará na ativação dos fibroblastos, levando a alterações em sua expressão gênica. O uso do receptor alfa do PDGF como marcador de fibroblastos resulta em populações isoladas e altamente enriquecidas de fibroblastos teciduais.

Neste exemplo, suspensões de células únicas de glândulas mamárias de camundongos foram coradas com anticorpos alfa do receptor PDGF e F quatro 80. O gráfico de classificação de fatos é mostrado no painel esquerdo, onde P dois é a porta dos fibroblastos e P quatro é a porta dos macrófagos. Uma análise pós-fonte foi realizada para determinar a pureza dos fibroblastos classificados mostrados no painel direito e dos macrófagos mostrados no painel do meio.

A próxima figura mostra uma análise da pureza de origem por Q-R-T-P-C-R de genes de controle específicos de células para fibroblastos, células imunes e células epiteliais. Os resultados foram normalizados para dois genes de manutenção, ga, DH e mgus, e a expressão relativa para gap. DH é mostrado, tais análises normalmente mostram 0,1 a 0,6% de contaminação.

Este nível de pureza permite o perfil de transcriptoma de alta qualidade de fibroblastos isolados. A quantificação da expressão do receptor alfa de PDGF em uma população não classificada de fibroblastos mamários indica que aproximadamente 85% do total de fibroblastos teciduais nas glândulas mamárias são positivos para o receptor alfa de PDGF. Eu me isolei.

Os fibroblastos podem ser cultivados diretamente após a triagem, mas podem levar alguns dias para se recuperar. É essencial realizar todos os experimentos adicionais com células de baixa massagem, pois os fibroblastos primários sofrem senescência durante a propagação. Em cultura, Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se for executada corretamente.

Se as células do terceiro forem designadas para serem cultivadas, elas são importadas para lembrar de realizar todo o procedimento em condições estéreis. Nesta filmagem, não realizamos uma classificação estéril. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar a população altamente enriquecida de fibroblastos do tecido fresco.