Name: Barwy Pasażowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych linii Trypsyna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-10-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj technikę pasowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych linii HuES przy użyciu trypsyny. Naucz się utrzymywać zdrowe, niezróżnicowane kultury z zachowaniem stabilności kariotypowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ogólny Zalecamy rozmrożeniu nie więcej niż jednej próbki w danym czasie, aby zapewnić łatwą obsługę. Obsługi należy uważać, aby nie pozostawić kultur w temperaturze pokojowej i CO2 niskie przez długi okres czasu. Wszystkie wirowania żywych komórek odbywa się w temperaturze 500-600 xg przez 5 min w temperaturze pokojowej. MEFs (mysz zarodkowych komórek Feeder) <ol><li> Pre-ciepłe mediów MEF do 37 ° C. Usuń fiolki MEF od -80 ° C i natychmiast zanurzyć pół probówki w łaźni wodnej 37 ° C. To powinno zająć około 30-45 sekund przed komórek 80% rozmrożone (małe mrożone lewej części). </li><li> Szybko doprowadzić rury do okapu przepływ laminarny, spray w dół z 70% alkoholu, a przeniesienie komórek do mediów ogrzana. </li><li> Zaaspiruj roztworu żelatyny z płytek przygotowanych wcześniej. </li><li> Podzielić na części 2 ml roztworu MEF w spadku sposób mądry w każdej z sześciu studni. Pamiętaj, aby równomiernie rozprowadzić MEFs o dobrze. Data płyty MEF, i umieścić w temperaturze 37 ° C w inkubatorze na noc, aby MEFs dołączyć do płyty. </li><li> Po 6 godzinach MEFs zostanie dołączony do płyty. Najlepiej jest używać płyt MEF 24-48 godzin po poszycia. NIE używać płyty MEF, że jest ponad 4 dni. </li><li> Pre-ciepłe barwy mediów i 0,05% Trypsyna / EDTA do 37 ° C Pod maską prelabel jeden jałowy 50 ml stożkowe rury. </li><li> Ostrożnie odciągnąć barwy mediów z kultury ma zostać podzielona. Delikatnie umyć studnie z 2 ml 1X buforowym roztworze fosforanowym (PBS) na studzienkę. Zaaspiruj PBS. Dodaj 0,75 ml 0,05% Trypsyna / EDTA do studni. </li><li> Wymienić pokrywę i obserwować komórki pod 4x powiększenie. MEFs wokół odcieni kolonie powinny zacząć się wycofać. Kiedy MEFs są dostatecznie zaokrąglone i granice barw kolonie są szorstkie, powrót płytkę do okapu. Proces ten powinien trwać około 5 minut, absolutnie nie dłużej niż 10 minut lub komórki nie będą ponownie rosnąć. </li><li> Delikatnie pipety w górę iw dół, mycie dna studni, do jednowarstwowych MEF całkowicie oderwane (monowarstwy jest lepka i może pozostać w jednym kawałku). </li><li> Przenieść zawiesinę komórek na 50 ml stożkowa rurka zawierająca dodatkowe barwy mediów. Spin rury komórek 500xg przez 5 minut, Zassać z nośnika, należy uważać, aby nie przeszkadzać osad komórek. </li><li> Aby płytki na nową płytkę z MEFs, dodać odpowiednio określona ilość komórek do dodatkowych odcieni media, i pipety rozwiązanie 5-7 razy ze zautomatyzowaną pipety. </li><li> Usuń MEF mediów z nowego płyty MEFs. </li><li> Podwielokrotności roztworu barwy kroplami do każdej studzienki, upewniając się, aby równomiernie rozprowadzić równomiernie spada o dobrze. Bez potrząsając płytki, dokładnie przywrócić te komórki do 37 ° C w inkubatorze na noc do wynajęcia barwy kolonii nasion. </li><li> Barwy komórek pochodzących z podziału powinny zachowywać się podobnie jak te pochodzące z odwilży. </li></ol>

<ol><li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals%3A+a+three-year+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li>
<li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li>
<li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li>
<li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li>
<li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li>
<li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans%3A+Development%2C+architecture%2C+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li>
<li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+biofilms+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li>
<li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+activity+of+amphotericin+B%2C+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li>
</ol>

W tym filmie pokazaliśmy, w jaki sposób rutynowo barwy fragment linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych w laboratorium. Sprawne i regularne dzielenie i pasaży jest niezbędna dla utrzymania zdrowego linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych. Przejście pośredniczy Trypsyna jest znaczącą przewagę odcieni linii komórkowych, jednak ważne jest nie do ponad trypsinize kultur i mieć duży udział pojedynczych komórek podczas ponownego Platting.

Barwy mediów 651,5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6,5 ml GlutaMAXTM 6,5 ml NEAA 6,5 ml 2-merkaptoetanolu 0.5ul KO Wymiana Serum 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng / ml końcowy) 0,65 ml

barwy pasażowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych linii trypsyna

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

W tym filmie pokazujemy, jak w naszym laboratorium rutynowo fragmenty barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych, z trypsyny. Ludzkich zarodkowych komórek macierzystych są artefakty hodowli komórek i mają tendencję do nabywania karyotypic nieprawidłowości z wysokiej podwojeń populacji. Właściwa pasaży jest niezbędna dla utrzymania zdrowego, niezróżnicowane, karyotypically normalne odcienie ludzkich macierzystych embrionalnych hodowli komórkowej. Po pierwsze, kultura rozwija przemyto w PBS w celu usunięcia resztek mediów i resztek komórek, a następnie komórkową zalewamy niewielką ilość ciepła 0,05% trypsyny-EDTA. Trypsyna jest w lewo na komórki do pięciu minut, a następnie komórki są delikatnie wypadają z 2 ml pipety serologiczne. Zawiesiny komórek są zbierane i mieszane z dużą ilością odcieni media, następnie komórki są zbierane przez delikatne wirowanie. Inaktywowane trypsyny mieszanki mediów jest usuwany, a komórki zawieszano w ogrzana barwy mediów. Odpowiedniego współczynnika podziału jest obliczana (zazwyczaj 1:10 do 1:20), a komórki ponownie wysiano na 1-2 dni stare płyty zawierające monowarstwy napromieniowanych myszy embrionalnych komórek podajnik fibroblastów. Nowo zasiane kultury barwy płyta jest w nienaruszonym stanie przez 48 godzin, a następnie wymiany nośnika na co dzień później. Ważne jest, aby nie trpsinize do pojedynczej zawiesiny komórek, ponieważ zwiększa to ryzyko wprowadzenia karyotypic nieprawidłowości.

W tym filmie pokazujemy, jak w naszym laboratorium rutynowo fragmenty barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych, z trypsyny.

Barwy Pasażowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych linii Trypsyna

W tym filmie demonstrujemy, w jaki sposób w naszym laboratorium rutynowo pasażujemy linie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych HuES przy użyciu trypsyny. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste są artefaktami...

To jest, gdzie uruchomiłeś techniki? Och, gdzie cię nauczyłem? Pierwszy raz, kiedy uczyłem cię Bel, spędziłem lato w moim T.Yeah.To było tak, jakbyśmy robili tam chrząstki. I tak spodobała mi się tamtejsza kultura społeczna. A potem, na ostatnim roku studiów w Hopkins, pracowałem z różnymi osobami, więc jeśli chodzi o inżynierię, to było o wiele bardziej próbowanie, projektujemy to trójwymiarowo.

passaging-hues-human-embryonic-stem-cell-lines-with-trypsin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje sposób hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) na warstwie komórek karmicielskich z embrionalnych fibroblastów mysich (MEF). Część 1 z 3.

Od MEF do Matrigelu I: Pasażowanie hESC w obecności MEF

Różnicowanie ESC zbiega się z charakterystycznymi dla danego typu komórek zmianami w strukturze i składzie chromatyny. Wykrycie tych zmian dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów definiujących pluripotencję oraz różnicowanie komórek. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi wartościową metodę analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek macierzystych. <br...

Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób utrzymania wzrostu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) w warunkach bez komórek karmionek oraz sposób ciągłego pasażowania hESCs w warunkach bez komórek karmionek. Przedstawiono również potwierdzenie pluripotencji hESCs hodowanych bez komórek karmionek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Część 3 z 3.

Od MEF do Matrigelu 3: Pasażowanie hESC z Matrigelu na Matrigel

Kariotypowanie jest prostą i użyteczną techniką powszechnie stosowaną do wykrywania zmian genetycznych. W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowy protokół przygotowania preparatów rozprzestrzeniających chromosomy z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w celu monitorowania stanu chromosomowego tych komórek utrzymywanych w hodowli.

Przygotowanie rozprzestrzenionego preparatu chromosomów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do analizy kariotypu

Opisujemy protokół oparty na małych cząsteczkach służący do różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC). Protokół ten pozwala na wysokowydajne generowanie komórek OPC Olig2+NG2+ w ciągu 30 dni różnicowania. Opisujemy również metodę generowania „spiking” OPC, które są zdolne do generowania potencjałów czynnościowych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów

Kierowana różnicowanie hESC w konkretne komórki wzbudziło duże zainteresowanie w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół służący do określania losów wybranych hESC in vivo, który stanowi cenne narzędzie do charakteryzacji reagentów specyficznych dla tkanek w terapiach komórkowych.

Mapowanie losów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez tworzenie potworniaków

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Ten protokół zapewnia prosty i skuteczny sposób namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) przy użyciu wyłącznie kondycjonowanych pożywek pochodzących z ludzkiego łożyska w naczyniu pokrytym żelatyną, bez dodatkowej suplementacji egzogennej lub syntetycznych substratów specyficznych dla hPSC.

Nowy model hodowli do namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie w pożywkach kondycjonowanych łożyskiem

Generowanie kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych in vitro umożliwia dostęp do dużych ilości tkanki serca in vitro dla nauk podstawowych i zastosowań klinicznych.  Protokół ten wykorzystuje czynnik przedsionkowy Grem2 zarówno do zwiększenia liczby uzyskanych kardiomiocytów, jak i do wytworzenia kardiomiocytów o fenotypie przedsionkowym.

Różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty BMP Grem2

Ta metoda może być użyta do zbadania skrócenia sarkomeru za pomocą kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych z fluorescencyjnie znakowanymi białkami sarkomerowymi.

Sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych.

Aby uniknąć ograniczeń związanych z enzymatycznym lub mechanicznym pasażowaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) hodowanych na komórkach żywicielskich, ustaliliśmy szybką, skuteczną, ekonomiczną, wysokowydajną metodę zbierania kolonii hESC lub hiPSC utrzymywanych na warstwie komórek zasilających ludzkie fibroblasty napletka za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA.

Szybkie, ekonomiczne, bezenzymatyczne pasażowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na komórkach zasilających przez dysadhezję za pośrednictwem kwasu etylenodiaminotetraoctowego

Poznaj technikę pasowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych linii HuES przy użyciu trypsyny. Naucz się utrzymywać zdrowe, niezróżnicowane kultury z zachowaniem stabilności kariotypowej.

Barwy Pasażowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych linii Trypsyna

Przeglądaj więcej filmów