A transfecção de proteína de rato Lung

O objetivo geral deste procedimento é transfectar a proteína para o pulmão do camundongo. Isso é feito suspendendo primeiro a proteína de interesse no reagente de transfecção do projeto. Em seguida, um camundongo é anestesiado e colocado em uma plataforma especial para injeção.

Uma fonte de luz é usada para auxiliar na inserção do micro pulverizador na traqueia. Finalmente, 50 microlitros de fluido contendo a proteína de interesse são injetados. Em última análise, essa técnica de transfecção de proteínas é usada para mostrar níveis aumentados de proteína nos pulmões de camundongos.

Embora esse método tenha sido projetado para uso em doenças pulmonares obstrutivas crônicas, ele também pode ser usado em outros estados de doença, como asma ou fibrose pulmonar. A demonstração visual desse método é crítica. Como as etapas de injeção intratraqueal são difíceis de aprender, elas requerem um posicionamento adequado das vias aéreas do camundongo e iluminação trans das cordas vocais.

Comece preparando primeiro o reagente de transfecção de proteínas. Adicione 250 microlitros de metanol ou clorofórmio ao tubo que contém o projeto seco. Filme. Em seguida, vortex o tubo por 10 a 20 segundos na velocidade máxima.

Uma vez dissolvido, pipete 20 microlitros de reagente de projeto em tubos de microcentrífuga separados. Coloque esses tubos sob uma capela de fluxo laminar para evaporar o solvente por no mínimo seis horas. À temperatura ambiente, os tubos devem estar completamente secos.

Armazene os tubos a menos 20 graus Celsius, onde permanecerão bons por um ano. No dia da transfecção, recupere uma alíquota de reagente de transfecção e a 50 microlitros de PBS contendo dois microgramas da proteína de interesse. Misture a solução por vórtice em baixa velocidade por três a cinco segundos e, em seguida, incube em temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar.

Quando a proteína estiver pronta, anestesie um camundongo para se preparar para a administração intratraqueal. Uma plataforma especialmente projetada é usada para injeção intratraqueal. Tem uma rampa em um ângulo de 45 graus de sua base e um fio de metal pendurado em dois ganchos na parte superior.

Uma vez anestesiado, esse fio é usado para pendurar o mouse em seus incisivos superiores. Depois que o mouse estiver preso, coloque uma fonte de luz contra a traqueia para ajudar na visualização das cordas vocais usando uma pinça e um clipe de papel. Como laringoscópio, abra a orofaringe e introduza o cateter.

Ao usar o pulverizador Micros, é importante usar força suficiente ao mergulhar no êmbolo. Caso contrário, em vez de gerar uma névoa fina, você criará gotículas que podem obstruir as vias aéreas do camundongo. Quando tudo estiver no lugar, injete 50 microlitros da mistura de proteínas através da traqueia usando um micro pulverizador de caneta século.

Neste exemplo, camundongos foram injetados intratraquealmente com albumina de camundongo ou beta galacto 24 horas após a transfecção de proteína beta galacto intenso. A coloração designada aqui pelas setas grandes foi detectada nas vias aéreas dos camundongos tratados com beta galacto, mas não nos camundongos tratados com albumina. Uma vez em massa, essa técnica pode ser realizada em 10 ou 15 minutos, uma vez executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer injeção intratraqueal em camundongos para transfecção de proteínas.