Name: 免疫療法のための腫瘍抗原にロードされた成熟樹状細胞の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶ 腫瘍免疫療法のための臨床グレード樹状細胞調製法。単球をGM-CSFとIL-4で分化させ、TLR3アゴニストで成熟させた後、腫瘍抗原をロードして患者に投与可能な細胞治療薬を作製する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、ポリICLCの贈り物のためにアンドレスサラザール（Oncovir株）に感謝したいと思います。

1。 PBMCを4の単離と凍結保存<ol><li>無菌スパイクプラズマ転送セットを使用して、白血球搬出袋のアクセスポートのいずれ。 60ミリリットル注射器を用いて、無菌の500mlボトルに患者から得られた白血球搬出を転送する。 </li><li>室温RPMIを用いて元のボリュームを2倍に白血球搬出の音量を調整します。徹底的に混ぜる。 </li><li>優しくフィコール - Paque PLUSのボトルを混ぜて。滅菌50ミリリットルコニカルチューブに12ミリリットルフィコール - Paque PLUSを追加します。 </li><li>フィコールを含む各滅菌50ミリリットルコニカルチューブに希釈白血球搬出製品の優しく層30ミリリットル。フィコールと細胞懸濁液との間のインターフェースを邪魔しないように注意してください。 </li><li>白血球搬出のすべてが積層されるまで手順1.3と1.4を繰り返します。 </li><li>ブレーキなしで室温で20分間、1,000×gで50ミリリットルコニカルチューブを遠心。 </li><li>慎重に各チューブとtransfe由来のPBMCの濁った層を収穫新しい無菌の50mlチューブにR。 </li><li> 50ミリリットルの最終体積に各チューブにRPMIを追加します。反転により穏やかに混合。 </li><li> 4時10分°Cフルブレーキ付、500×gで、細胞を遠心分離します。 </li><li>各チューブから上清を取り除きます。各チューブからの細胞ペレットを再懸濁し、50 mlの最終容積にRPMIを追加します。反転により穏やかに混合。 </li><li> 500×4で6分間遠心℃で細胞を遠心</li><li>各チューブから上清を取り除きます。再懸濁し、1 50ミリリットルコニカルチューブに一緒にプールに細胞懸濁液を。 </li><li>もっとRPMIで50 mlにプールされた末梢血単核球の体積を持ち出す。反転により穏やかに混合。 </li><li> 300×4で6分間遠心℃で細胞を遠心</li><li>上清を取り除きます。 50ミリリットルRPMIで細胞ペレットを再懸濁します。均一な細胞懸濁液を確実にするために穏やかに混合する。 </li><li>セルの数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞の総数を計算します。 </li><li> 300で細胞を遠心×4で6分間遠心℃、凍結メディアを準備します。ヒトAB血清（バレーバイオメディカル）において、凍結培地は、10％ジメチルスルホキシド（DMSOミルテニーバイオテク社）で構成されています。 </li><li>上清を取り除きます。寒い凍結メディアで2×10 8細胞/ mlの最終濃度で細胞を再懸濁します。 </li><li> 1.8ミリリットルのクライオバイアルに1ミリリットルのアリコートを作る。 </li><li>制御された速度冷凍庫にクライオバイアルに移し、凍結実行、プログラム1を開始します。実行の最後に、直ちに液体窒素冷凍庫の気相に凍結クリオバイアルを移す。 </li></ol> 2。 0日目：単球から樹状細胞の分化<ol><li>滅菌50ミリリットルコニカルチューブにRPMI / 1％自己血漿30mlのを追加します。 </li><li> 37℃の水浴中で穏やかに撹拌によって凍結したPBMCの融解アリコート。完全に解凍すると、無菌の50ミリリットルコニカルチューブにバイアルの内容を転送します。徹底的に混ぜる。 </li><li> 6分間、細胞を遠心分離室温で500×gで。上清を除去し、RPMI / 1％自己血漿少量のペレット化した細胞を再懸濁します。次いで50 mlの最終容積にもっとRPMI / 1％自己血漿を追加します。徹底的に混ぜる。 </li><li> 500で6分×gで室温では再び細胞を遠心分離。上清を吸引し、50ミリリットルRPMI / 1％自己血漿でペレットを再懸濁します。徹底的に混ぜる。 </li><li>セルの数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞の総数を計算します。 </li><li>プレート1.40 40 RPMIのミリリットル/ 225センチメートル2 EasyFlaskへ1％自家血漿中×10 8細胞。すべての細胞がメッキされているまで繰り返します。 </li><li> 1のためにその側にフラットEasyFlasksをインキュベート- 37で2時間°組織培養インキュベーターでCは単球がフラスコに付着できるように、5％CO 2を含む。 </li><li>インキュベーションが完了したら、インキュベーターからEasyFlaskを除去し、非接着細胞USIを除去するために二回洗っNG温めRPMI 30mlの。 </li><li>二回目の洗浄後、400〜1,000 IU / mlのIL-4および100〜1,000 IU / mlのGM-CSF 5-8でRPMI / 1％自己血漿40 mlを加える。このプロトコルのために、我々は400 IU / mlのIL-4、100 IU / mlのGM-CSFを使用しています。 </li><li> 37℃で2日間EasyFlasksをインキュベート°組織培養インキュベーター中でCが5％CO 2を含む。 </li></ol> 3。 2日目：IL-4およびGM-CSFを有する樹状細胞の給餌<ol><li> 400〜1,000 IU / mlのIL-4および100〜1,000 IU / mlのGM-CSFで各EasyFlaskにRPMI / 1％自己血漿4 mlを加え。渦巻くとその側に揺動混ぜる。 </li><li> 37℃の組織培養インキュベーター中、5％CO 2を含むでより多くの3日間EasyFlasksを（5日まで）インキュベートする。 </li></ol> 4。 5日目：未成熟樹状細胞の収穫<ol><li>精力的にフラスコを渦巻くことで、非粘着性と緩く接着細胞を再懸濁するために上下にピペッティングにより文化を収穫。転送新しい50 mlコニカルチューブに回収した細胞。 </li><li>室温で6分間、500×gでチューブを遠心する。上清を取り出し、50ミリリットルRPMI / 1％自己血漿で細胞ペレットを再懸濁します。徹底的に混ぜる。 </li><li>セルの数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞の総数を計算します。 </li><li>室温で6分間、500×gでチューブを遠心する。 3ミリリットルRPMI / 6ウェル組織培養プレートで400 IU / mlのIL-4および100 IU / mlのGM-CSFと1％の自己血漿中のウェル当たりプレート1-2×10 6細胞。 </li><li> 37℃でプレートをインキュベート℃で組織培養インキュベーターでは2晩、5％のCOを含む。 </li></ol> 5。 6日目：樹状細胞の成熟と抗原読み込み<ol><li> 10μgの/ mlのKLHに6ウェル培養プレート中のウェルの1/3を入れる。渦巻プレートが混合する。 KLHにのみ第1のDCワクチンに使用されるためKLHは、ウェルの1/3に添加する。その後のDCワクチンの詐欺唯一の腫瘍抗原ペプチドをTainの。 </li><li> DCは異なる刺激を使用して成熟し刺激することができる。臨床試験で用いられている最も一般的な成熟刺激サイトカインのカクテル（IL-1β、TNFαおよびIL-6）及びプロスタグランジンE2（PGE 2）9,10されている。より最近では、Toll様受容体（TLR）アゴニストの使用は人気11,12を集めている。このプロトコルでは、ウェルに2 mg / mlのポリイノシン-ポリシチジル酸-ポリ-L-リジンカルボキシメチルセルロース（ポリICLC）を追加し、よく混ぜる。ポリICLCは、ポリ-L-*-リジンおよびカルボキシメチルセルロース（Oncovir社製）で安定化されているポリ-ICの臨床グレードの製剤である。 </li><li>各ウェルクロス競争13を回避する唯一の単一のペプチドを受け、それらの指定されたウェルには100μg/ mlの長いペプチド抗原（NY-ESO-1および/ ​​またはMelan-A/MART-1）を追加します。 </li><li> 37℃のプレートをインキュベートし、組織培養におけるCインキュベーターがCO 5％を含む&lt;サブ&gt; 2 O / N </li></ol> 6。 7日目：樹状細胞の凍結保存<ol><li>自己血漿および10％DMSOを使用してDC凍結溶液を調製。任意の粒子状物質を除去するために4℃で20分間2,000のDC凍結ソリューション×gで遠心します。新しいラベル15ミリリットルコニカルチューブに上清を移します。 4℃で保存し、使用するまでC。 </li><li>一晩のインキュベーションが終了し、収穫、プール50ミリリットルコニカルチューブにペプチドをパルスした樹状細胞を含むすべての井戸。 </li><li> 6分間500×gでチューブを遠心する。上清を取り除きます。 RPMI / 1％自己血漿5mlの細胞ペレットを再懸濁します。 RPMI / 1％自己血漿で50 mlに総量を持ち出す。徹底的に混ぜる。 </li><li>セルの数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞の総数を計算します。 </li><li>室温で6分間、500×gでチューブを遠心する。上清を取り出し、5ミリリットル殺菌の各ペレットを再懸濁しル0.9％のNaCl、USPおよび新しい15ミリリットルコニカルチューブに移す。より滅菌0.9％のNaCl、USPは14 mlに各細胞懸濁液を持参してください。反転によってキャップとミックス。 </li><li>二回前の手順を繰り返します。最後の遠心分離後、上清を除去し、ペレットを乱すことなく、細胞ペレットにできるだけ近くになって。 </li><li> 4のDC凍結溶液中の細胞ペレットを再懸濁し- 20×10 6細胞/ mlとアリコートそれぞれ1.8ミリリットルのクライオチューブバイアルに1ミリリットル。 </li><li> DCワクチンのアリコートを下に凍結し、長期保存のために液体窒素冷凍庫の気相中にすぐに転送するために、制御された速度冷凍庫、プログラム1を使用します。 </li></ol> 7。ロットリリーステスト<ol><li>それは典型的には5〜6週間ワクチン調製後、研究では患者への注射のためにリリースされる前に、DCワクチンの各バッチが評価され、特定のロットリリース基準（ 表1）を満たしている必要があります。 </li><li> 生存：自動細胞計数器を用いたDCワクチンの有効性を評価する。最小許容生存仕様は&gt; 70％である。 </li><li> アイデンティティ：フローサイトメトリーによる成熟DC（CD11cは+ CD14-CD83 +）の身元を評価する。のCD11c +細胞の割合は&gt; 50％であるべきである。 CD11c陽性の割合は+およびCD14 +細胞が&lt;30％のCD11c +、の割合がCD14-、およびCD83 +細胞がなければならない&gt;ことが50％。べき</li><li> 不妊：直接文化やグラムの汚れで嫌気と好気性細菌や真菌の存在のためのテストのDCワクチン。インジケータセルラインと直接培養系及びDNA蛍光色素染色アッセイを用いてマイコプラズマの存在を評価します。これらのテストでは、最小の仕様セットは成長がすべての培養物から観察されないということである。 </li><li> エンドトキシン：キネティック-QCLカイネティック発色LALアッセイを用いてエンドトキシンの内容を評価し、それが最低基準を満たすために&lt;50 EU / mlのでなければなりません。 </li><lI&gt; 機能：同種T細胞とのインキュベーションによって混合リンパ球反応においてDC機能を評価します。刺激されていない樹状細胞と比較して増殖の存在が（ 図3）が報告されている。 </li></ol>

<ol><li>Lesterhuis, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+vaccines+in+melanoma%3A+from+promise+to+proof%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).</li>
<li>Sabado, R. L., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+dendritic+cell+immunotherapy+towards+successful+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment.</a> Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).</li>
<li>Schumacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keyhole+limpet+hemocyanin+%28KLH%29+conjugate+vaccines+as+novel+therapeutic+tools+in+malignant+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer.+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, Suppl 2. 1-2 (2001).</li>
<li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1(2007).</li>
<li>Eichler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+study+on+in+vitro+characterization+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells.</a> Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).</li>
<li>Feuerstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+production+of+cryopreserved+aliquots+of+antigen-preloaded%2C+mature+dendritic+cells+ready+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use.</a> J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).</li>
<li>O'Neill, D., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+autologous+peptide-+and+protein-pulsed+dendritic+cells+for+patient-specific+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy.</a> Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).</li>
<li>de Vries, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypical+and+functional+characterization+of+clinical+grade+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells.</a> J. Immunother. 25, 429-438 (2002).</li>
<li>Jonuleit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+cytokines+and+prostaglandins+induce+maturation+of+potent+immunostimulatory+dendritic+cells+under+fetal+calf+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions.</a> Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).</li>
<li>Lee, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+grade+cocktail+of+cytokines+and+PGE2+results+in+uniform+maturation+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells%3A+implications+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy.</a> Vaccine. 20, Suppl 4. A8-A22 (2002).</li>
<li>Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+immune+system+to+treat+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Harnessing the immune system to treat cancer.</a> J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).</li>
<li>Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+agonists%3A+are+they+good+adjuvants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?</a> Cancer J. 16, 382-391 (2010).</li>
<li>Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+dominance%2C+competition+and+T+cell+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation.</a> Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).</li>
<li>Bogunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR4+engagement+during+TLR3-induced+proinflammatory+signaling+in+dendritic+cells+promotes+IL-10-mediated+suppression+of+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity.</a> Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).</li>
<li>Verdijk, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyriboinosinic+polyribocytidylic+acid+%28poly%28I%3AC%29%29+induces+stable+maturation+of+functionally+active+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells.</a> J. Immunol. 163, 57-61 (1999).</li>
<li>Rouas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28I%3AC%29+used+for+human+dendritic+cell+maturation+preserves+their+ability+to+secondarily+secrete+bioactive+IL-12%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12.</a> Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).</li>
<li>Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1-polarizing+capacity+of+clinical-grade+dendritic+cells+is+triggered+by+Ribomunyl+but+is+compromised+by+PGE2%3A+the+importance+of+maturation+cocktails%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails.</a> J. Immunother. 28, 480-487 (2005).</li>
<li>Krause, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+is+a+key+factor+for+monocyte-derived+dendritic+cell+maturation%3A+enhanced+T+cell+stimulatory+capacity+despite+IDO%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO.</a> J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).</li>
<li>Morelli, A. E., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+under+the+spell+of+prostaglandins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells under the spell of prostaglandins.</a> Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).</li>
<li>Adams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+%28DC%29+based+therapy+for+cervical+cancer%3A+use+of+DC+pulsed+with+tumour+lysate+and+matured+with+a+novel+synthetic+clinically+non-toxic+double+stranded+RNA+analogue+poly+%5BI%5D%3Apoly+%5BC%2812%29U%5D+%28Ampligen+R%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R).</a> Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).</li>
<li>Colombo, M. P., Trinchieri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-12+in+anti-tumor+immunity+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).</li>
<li>Dhodapkar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+broad+T-cell+immunity+in+humans+after+a+single+injection+of+mature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells.</a> J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).</li>
<li>Schuler-Thurner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+of+tumor-specific+type+1+T+helper+cells+in+metastatic+melanoma+patients+by+vaccination+with+mature%2C+cryopreserved%2C+peptide-loaded+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells.</a> J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).</li>
</ol>

NIH（AI061684、AI071078、AI044628、およびK08 AI084578（ミラー））、ビル＆メリンダ·ゲイツ財団、ドリス·デューク慈善財団、がん研究所、ループス研究のための同盟、そしてエメラルド：著者は、次の中から財政支援を受けている財団。ニーナBhardwajは、免疫力を操作するために、樹状細胞の調製および使用に関連した特許に関する共同発明者である。著者らは、他の関連する提携または任意の組織または団体の金融関心を持つか、または離れて開示されているものから原稿で議論主題または材料と金融紛争を有する金融関わりを持っていません。

フェーズIおよびIIは、単球由来樹状細胞の臨床試験は、患者しかしながら、臨床的成功は1に限定されているにおける免疫応答を誘導することが示されている。これは、腫瘍免疫療法用に最適DCを生成する方法に関するコンセンサスが不足している一因であってもよい。臨床グレードのDCを生成する多数の方法があるが、これらの方法は、単球、成熟を誘導するために使用される刺激、および抗原負荷のメソッドを区別するために使用されるサイトカインの使用の点で異なる。最適なDCを生成するための式は、依然として2で定義されていない。 in vitro試験では、最近のDCは、臨床試験の大部分で使用されている炎症性サイトカインのカクテルで10成熟特にPGE2の存在は、制御性T細胞およびTh2応答17、明白なIDOの分化を誘導することが示されている18、及びIL-12p70のに不十分である生産19。これらの効果は、有意な免疫応答を誘導するため、in vivoで</em...

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 培地 L-グルタミン</td><td>BioWhittaker</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES 緩衝生理食塩水</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td> <td>BioWhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>ヒトアルブミン、25% 溶液 USP</td><td>Aventis Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>ヒト AB 血清</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水 USP</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS DMSO </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>ロイキン GM-CSF、0.5 mg/ml</td><td>Berlex</td><td>A02266</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP IL-4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-101</td><td></td></tr><tr><td>ヒルトン、ポリICLC、2 mg/ml</td><td>オンコビル</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>VACMUNE KLH</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>225 sq cm EasyFlasks</td><td>Nalgene Nunc</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6 ウェル組織培養プレート</td><td>Becton Dickinson 353046</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml CryoTube バイアル</td><td>Nalgene Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Rate Freezer</td><td>Thermo</td><td>CryoMed</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫療法のための腫瘍抗原にロードされた成熟樹状細胞の調製

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

臨床研究は、抗原·ロードDCワクチンは腫瘍1のための安全かつ有望な治療法であり、それらの臨床的有効性が確立されて残っていることが確立しているが。方法は、良好な製造技術（GMP）のガイドラインに準拠して作成、後述するように、臨床研究のためのDC 2を大量に生成するための最も一般的なex vivoでの調製方法の最適化である。 提案手法では、樹状細胞を刺激するための合成TLR 3アゴニストポリイノシン - ポリシチジル酸 - ポリ-L-リジンカルボキシメチルセルロース（ポリICLC）を利用する。 CD83およびCD86のアップレギュレーションにより評価されるポリICLCはヒトDCのための最も強力な個々の成熟刺激であることが確立我々の以前の研究では、インターロイキン12の誘導（IL-12）、腫瘍壊死因子（TNF）、インターフェロンγ誘起タンパク質10（IP-10）、interleukmin 1（IL-1）、I型インターフェロン（IFN）、および最小のインターロイキン10（IL-10）産生。 </p&gt; 樹状細胞は、白血球搬出により得られた凍結末梢血単核細胞（PBMC）から区別される。 PBMCを、フィコール勾配遠心分離によって単離し、アリコートで凍結する。 1日目では、PBMCを解凍され、℃の中の組織培養インキュベーターで、37〜2時間インキュベートした後、プラスチック表面に付着した単球を選択するために組織培養フラスコに播種。インキュベーション後、リンパ球が洗い落とされ、接着単球を未成熟DCに分化するインターロイキン-4（IL-4）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の存在下で5日間培養する。 6日目に、未成熟DCは、ワクチンの品質の制御として機能し、ワクチン3の免疫原性を高めることがキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）タンパク質でパルスされています。 DCは、成熟に刺激ペプチド抗原を搭載し、一晩インキュベートする。 7日目に、細胞を洗浄し、含有する、1mlのアリコートで凍結4 -制御された速度冷凍庫を使って20×10 6細胞。 DCのバッチのロットリリーステストが行​​われ、それらが患者に注入される前に、最低限の仕様を満たしている必要があります。

10との間 - 出発したPBMCの20％は培養期間の終了時にDCへと分化する。成熟DCはあるのCD11c +、CD14-、CD83 +、CD40 +、およびCCR7 +（ 図1）。それらは、MHCクラスIおよびII分子および共刺激分子CD80およびCD86の高いレベルを発現する。他のTLRアゴニスト14と比較して、ポリICLCまた、PDL-1の低レベルを誘導した。さらに、これらのポリIC-成熟DCを分泌する大IL-12の量（ 図2及び15,16）とは、同種T細胞（ 図3）の増殖を誘導する。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50085/50085fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50085/50085fig1.jpg" /><...

腫瘍免疫療法に使用するための自​​己樹状細胞（DC）を大量に生成するための最も一般的に使用される方法が記載されている。この方法は、単球から樹状細胞を区別するためにIL-4およびGM-CSFを使用する。彼らは患者に再び注入される前に、未成熟DCは、成熟した後、抗原でロードに刺激される。

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

この手順の目的は、免疫療法に用いる臨床グレードの樹状細胞の調製法を示すことです。まず、白血球アフェレーシスから単離した末梢血単核球（pbmc）を凍結します。次に、凍結保存したpbmcの分注液を融解し、G-M-C-S-FおよびIL-4の存在下で5日間単球を樹状細胞へと分化させます。次に、樹状細胞を回収し、ペプチドでパルスした後、TLR3アゴニストであるpoly ICLCを用いて一晩熟成させます。最終ステップでは、成熟した樹状細胞を回収し、分注して凍結保存します。これらの凍結保存された成熟樹状細胞のアリコートを解凍し、シリンジに移して、免疫療法のプロセスとして患者に再投与します。手順のデモンストレーションは、私の研究室のリサーチテクニシャンであるSediaとFarra Hassanが行います。プラズマ転送セットを用いて、白血球アフェレシスバッグのアクセスポートの1つを無菌的に穿刺します。次に、60 mLシリンジを使用して、白血球アフェレシス液を滅菌済みの500 mLボトルに転送します。続いて、室温のRPMIを用いて、白血球アフェレシス液の容量を元の2倍に調整し、十分に混合します。Fial Pack Plusのボトルを静かに混合した後、その溶液を12 mLずつ滅菌済みの50 mLコニカルチューブに分注し、その上に希釈した白血球アフェレシス製品を30 mLずつ慎重に重層します。Ficollと細胞懸濁液の界面を乱さないように注意してください。チューブを1000 g、室温で20分間、ブレーキなしで遠心分離します。その後、各チューブからPBMCの白濁層を慎重に回収し、新しい滅菌済みの50 mLチューブに移します。次に、各チューブにRPMIを加えて最終容量を50 millilitersにし、転倒混和により細胞懸濁液を穏やかに混ぜます。500 Gs、4 °Cで10分間遠心分離した後、各チューブから上清を除去し、各チューブの細胞ペレットをRPMIで最終容量50 millilitersまで再懸濁します。チューブを転倒混和で穏やかに混ぜた後、細胞数と生存率を測定します。次に、細胞を遠心分離し、最終濃度が2×10⁸ cells/mLになるように、調製したばかりの凍結保存液でペレットを再懸濁します。1 mLの細胞溶液を1.8 mLクライオバイアルに移します。その後、クライオバイアルをプログラムフリーザーに移し、凍結処理を開始します。処理終了後、凍結したクライオバイアルを直ちに液体窒素保存容器の気相部に移します。翌日、凍結保存したp BMCsのアリコートを37 °Cの水槽に入れ、穏やかに撹拌して解凍します。完全に解凍後、バイアルの内容物を、30 mLのRPMIと自己血漿を含む滅菌済み50 mLコニカルチューブに移し、遠心分離します。細胞ペレットを少量のRPMIおよび自己血漿で慎重に再懸濁

preparation-tumor-antigen-loaded-mature-dendritic-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、マウスの骨髄から骨髄樹状細胞を区別するための手順を示しています。マウス脛骨と大腿骨、および骨髄の処理の分離が実証されています。細胞の表現型とのCpGを用いてIL -...

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

樹状細胞による二次リンパ器官における抗原提示がT細胞媒介免疫応答の開始に重要です。ここでは、マウス樹状細胞を骨髄由来の文化、活性化、および2光子イメージングのための標識を示す。...

2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

我々は、細胞の成熟を引き起こすことなく、プラスミドDNAやsiRNAのどちらかで初代ヒト単球由来樹状細胞をトランスフェクトの効率的な方法として私たちの最適化されたハイスループットnucleofectionのプロトコルを提示する。我々はさらなる標的遺伝子のmRNAとタンパク質レベルの両方におけるRIG -...

細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル

同系免疫担当宿主において評価された癌幹細胞(CSC)ベース樹状細胞(DC)ワクチンは、異種バルク腫瘍細胞でパルスされた従来のDCワクチンよりも有意に高い抗腫瘍免疫を示した。...

黒色腫と扁平上癌幹細胞を用いた新規樹状細胞ワクチンの生成

未成熟樹状細胞は、免疫と耐性のバランスを調整するために、寛容性または成熟性樹状細胞に選択的に分化させることができます。この研究は、未熟な単球由来樹状細胞(moDC)、代謝表現型が異なるin...

代謝表現型が異なる未熟、熟女と寛容原性樹状細胞の生成

マウス単球由来樹状細胞とその後続の in Vitro活性化腫瘍免疫複合体との隔離のプロトコル

ここでは、開発し免疫寛容樹状細胞 (TolDCs) の特徴し、その免疫療法の有用性を評価するためのプロトコルを提案する.

開発とマウス免疫寛容樹状細胞の機能解析

Transimmunization (TI) デバイスまたはプレートと関連するプロトコルは、実験的な設定で、体外光化学療法 (ECP) の主要な機能を再現するために開発されており、生理活性、チューナブル樹状の生産を可能にします癌免疫療法のための細胞...

生理学的免疫原性樹状細胞を生成するための新規プロトコル

このプロトコルは、Flt3L発現B16-F10黒色腫を伴う細胞ベースの腫瘍ワクチン接種を使用した癌免疫療法モデルを提示します。このプロトコルは、培養腫瘍細胞の調製、腫瘍移植、細胞照射、腫瘍増殖の測定、腫瘍内免疫細胞の分離、フローサイトメトリー分析などの手順を示しています。...

造血サイトカインによる腫瘍ワクチン接種を用いた実験的黒色腫免疫療法モデル

シアリダーゼ処理を使用して、単離された末梢血単核細胞(PBMC)から脱シアル化ヒト単球由来樹状細胞(mo-DC)を生成するための独自の包括的なプロトコルが提示されます。さらに、mo-DCの表現型および機能特性を評価し、シアリダーゼ処理がmo-DCの成熟レベルをどのように改善するかを評価する方法が記載されている。...

シアル化表現型の異なる単球由来樹状細胞の作製

このプロトコルは、転写因子PU.1、IRF8、およびBATF3の強制発現を通じて、腫瘍微小環境内のマウスがん細胞を1型樹状細胞にin vivo...

腫瘍細胞の1型従来の樹状細胞様細胞への扱い可能な in vivo 再プログラミング

学ぶ 腫瘍免疫療法のための臨床グレード樹状細胞調製法。単球をGM-CSFとIL-4で分化させ、TLR3アゴニストで成熟させた後、腫瘍抗原をロードして患者に投与可能な細胞治療薬を作製する方法です。

免疫療法のための腫瘍抗原にロードされた成熟樹状細胞の調製

さらに動画を探す