Name: Ex Vivo Blood Red emolisi test cellulare per la valutazione degli agenti Endosomolytic pH-sensibile per la consegna dei farmaci citosolico Biomacromolecular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Scopri il test di emolisi su globuli rossi per valutare vettori di drug delivery pH-sensibili. Questo metodo quantifica la potenziale rottura della membrana endosomica per migliorare la consegna intracellulare di farmaci biologici.

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Gli autori riconoscono il finanziamento attraverso il Dipartimento della Difesa dal Congresso Regia programmi di ricerca medica (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056), e American Heart Association (# 11SDG4890030).

1. Preparazione e sterilizzazione di buffer e agenti di test <ol><li> 150 mM NaCl tampone: sciogliere 4,383 g di cristalli di NaCl in 500 ml di acqua Nanopure. </li><li> Buffer pH: Preparare tamponi fosfato a pH 5.6, 6.2, 6.8, e 7.4 mescolando quantità appropriate di monobasico e sodio fosfato bibasico. Se i campioni devono essere sottoposti a valori di pH più bassi (pH &lt;5.6) poi un buffer più appropriato, come il tampone citrato, dovrebbe essere usato. Ricette del buffer sono facilmente disponibili, e un esempio di riferimento è stato fornito qui 12. </li><li> Sterilizzare tutti i buffer notato in precedenza attraverso una bottiglia-top gli aspiratori per filtrazione e ricontrollare tampone di pH. </li><li> 20% Triton X-100 (controllo positivo): Mescolare 20 ml puro Triton X-100 in 80 ml di acqua Nanopure. Vortex vigorosamente e ultrasuoni per sciogliere. Lasciare a temperatura ambiente per una notte prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione di eritrociti <ol><li> Ottenere 25 ml di sangue from un donatore anonimo umano, disegnato direttamente in K 2-EDTA rivestite vacutainer per prevenire la coagulazione. </li></ol> NOTA: Tutte le procedure devono essere pre-approvato dal Consiglio appropriata revisione istituzionale (IRB) e prelievo venoso e raccolta del sangue deve essere eseguita da un flebotomo addestrato al fine di minimizzare il rischio per il donatore. Procedure standard di flebotomia sono stati pubblicati altrove 13. <ol start="2"><li> Centrifugare il sangue a 500 xg per 5 minuti, ed i livelli di ematocrito marchio (rosso, strato inferiore) e plasma (giallo, strato superiore) sul tubo. </li><li> Aspirare delicatamente plasma tramite una micropipetta, aggiungere in candeggina, e gettare in rifiuti a rischio biologico. </li><li> Riempire tubo di ematocrito alla linea marcata (livello iniziale del plasma) con 150 mM di soluzione di NaCl. Chiudere e capovolgere un paio di volte per mescolare delicatamente. Centrifugare a 500 xg per 5 min. </li><li> Ripetere il passaggio 2,3-2,4 per lavare le cellule del sangue di nuovo. Poi aspirare Supernatformica e sostituirlo con PBS a pH 7,4. Capovolgere per miscelare. </li><li> Dividere il sangue in modo uniforme in quattro tubi, corrispondente a ciascun pH che sarà testato. Etichettare i tubi secondo ognuna pH da testare (5,6, 6,2, 6,8, 7,4). </li><li> Centrifugare provette a 500 xg per 5 min. Segna i livelli su tubi, quindi aspirare il surnatante. </li><li> Riempire ogni provetta di linea contrassegnata con tampone di pH adeguato (come indicato in 2.6). </li><li> Etichettare quattro provette da 50 ml coniche (uno per pH a test), e pipettare 49 ml di PBS a pH appropriato in ciascuna provetta conica. </li><li> Aggiungere 1 ml di eritrociti (pH stesso) nel tubo corrispondente per una diluizione 1:50. Ispezionare visivamente il sangue diluito, che deve essere torbida e si sistemerà, se lasciati indisturbati. Se nessuna forma di pellet, le cellule sono lisate. </li></ol> 3. Lysis Assay 96 pozzetti Piastra di supporto e di quantificazione <ol><li> Preparare soluzioni di base di tutti gli agenti sperimentali di consegna della droga, a 20 volte la concentrazione finale desiderata da sottoporre a prova (testavrà 10 ml di agente di consegna della droga + 190 ul cellule rosse del sangue diluito, che portano ad una diluizione 1/20 di un agente originale di somministrazione di farmaci in miscela di prova finale). Stock di 20, 100, e 800 pg / ml sono suggeriti, risultante in concentrazioni finali di 1, 5, e 40 pg / ml, rispettivamente. </li><li> Pipettare 10 ml di ciascuna soluzione madre in fondo a V da 96 pozzetti. Per ottenere risultati ottimali, caricare ciascun campione in triplicato o quadruplicato. </li></ol> NOTA: per facilità, si raccomanda una distinta piastra a 96 pozzetti deve essere preparato per ciascun pH da testare, con ciascun campione (per ogni concentrazione) caricato con n = 3-4 per piastra. <ol start="3"><li> Per pozzetti di controllo positivi, aggiungere 10 ml di 20% Triton X-100. </li><li> Per i pozzetti di controllo negativo, aggiungere 10 ml di tampone fosfato. Utilizzare tampone al pH stesso da testare. </li><li> Dispensare 190 ml di eritrociti diluiti (vedi 2.10) in ogni pozzetto, assicurandosi soluzione madre cella rimaneomogenea durante il trasferimento. Suggerimento: Utilizzare pipetta multicanale per semplificare questo compito. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C per un&#39;ora (Opzionale: Utilizzare un agitatore orbitale o rocker). </li><li> Centrifugare piastre per 5 min a 500 xg per eritrociti pellet intatti. Nota: quando si rimuove la placca dalla centrifuga e il trasporto al passo successivo, maneggiare con cura ed essere certi di non disturbare il pellet. </li><li> Usando una pipetta multicanale, trasferire 100 pl di surnatante da ciascun pozzetto in una chiara, a fondo piatto da 96 pozzetti. Nota: se il pellet cellulare è accidentalmente disturbato per ogni campione (s), si può ri-centrifugare la piastra e quindi procedere con il trasferimento supernatante. </li><li> Misurare assorbanza di supernatanti con un lettore di piastre. Si noti che un intervallo di lunghezze d&#39;onda possono essere utilizzati (400-541 nm). </li></ol> NOTA: lettori di piastre diverse possono avere punti di saturazione e sensibilità diverse, in modo che la scelta di una lunghezza d&#39;onda per measurements dipende se i dati di emolisi campioni sperimentali può essere normalizzati affidabile contro emolisi massima indotta dal trattamento detergente. Questo richiede una misurazione precisa valori di assorbanza dei campioni di controllo positivi. <ol start="10"><li> Utilizzo di Microsoft Excel o un simile software di analisi dei dati, trovare la media delle letture di assorbanza lo sfondo da campioni di controllo negativo create per ogni pH (punto 3.4). Sottrarre questo valore assorbanza di fondo da tutti gli altri campioni che sono stati misurati in quel pH. </li><li> Dopo sottrazione del fondo, trovare l&#39;assorbanza media del controllo positivo detergente trattati con campioni (punto 3.3). Poi normalizzare tutti i punti dati sperimentali a questo valore medio di assorbanza, che dovrebbe rappresentare il 100% emolisi. Infine, moltiplicare ogni valore ben del 100% per calcolare emolisi% che si è verificato in ogni singolo pozzetto rispetto al controllo detergente. </li></ol>

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</ol>

IRB di approvazione: Procedure che coinvolgono soggetti umani sono stati approvati dal Comitato di Revisione Vanderbilt University Consiglio Istituzionale (IRB; protocollo # 111251). Nessun conflitto di interessi dichiarati.

pH-sensibili polimeri o altri agenti destinati endosomolytic funzione può essere rapidamente ed efficacemente proiettato sulla base di lisi dei globuli rossi a pH incontrate in endosomi (Figura 1; pH 6,8 - endosoma precoce, pH 6,2 - endosoma tardi, pH 5,6 - lisosoma). 14-17 pH-dipendente emolisi è stato utilizzato per schermare la capacità dei vettori di mediare endosomal rilascio di peptidi terapeutici biomacromolecular (ad esempio, siRNA, ODN, proteine), ed i risultati di questa an...

Sebbene vi siano molti potenziali obiettivi terapeutici impatto elevato all&#39;interno della cellula, la consegna intracellulare di agenti rappresenta una sfida significativa. Spesso, i farmaci biologici, in particolare, vengono internalizzati dalle cellule e trafficata in vescicole che o portare al degrado del loro contenuto tramite l&#39;endo-lisosomiale via, o vengono trasportati indietro fuori dalla cellula tramite esocitosi. 1 In quest&#39;ultimo processo, il pH interno delle vescicole viene acidificata a circa 5-6, che è il pH ottimale per l&#39;attività di enzimi che funzionano in questo vano, ad esempio il lisozima. 2 Recentemente, un certo numero di materiali sono stati specificamente progettati per sfruttare l&#39;acidificazione di endosomi per facilitare l&#39;erogazione citosolico del loro carico. Un esempio di questo approccio utilizza nanoparticelle polimeriche sintetiche, micelle cui anima è zwitterionici e carica neutra a pH fisiologico (cioè 7,4). Tuttavia, a pH 6,0- 6,5, i polimeri diventano protonati e acquisire una carica positiva netta che destabilizza il nucleo micelle, e segmenti polimerici esposti interagire e distruggere la membrana endosomiale. Questa attività è stato dimostrato per promuovere la fuga endosomiale di peptidi e acido nucleico-terapie basate, consentendo loro di accedere ai bersagli citosolico. 3,4 Altri esempi di metodi sviluppati per mediare fuga endosomiale che distruggere la barriera membrana includono &#39;fusogenico&#39; peptidi o proteine ​​che possono mediare la fusione della membrana o transitoria formazione di pori nel doppio strato fosfolipidico. 5 omopolimeri di acidi acrilici anionici alchile come acido poli (propylacrylic) sono un altro approccio ben studiato, e in questi polimeri, lo stato di protonazione di acido carbossilico detta sospensione transizione in una idrofobica, membrana dirompente stato in endo-lisosomiale intervalli di pH. 6,7 Un sistema modello utile per lo screening di comportamento endosomolytic è l&#39;indirizzox pH-dipendente vivo dosaggio emolisi. 8 In questo sistema modello, la membrana eritrocitaria serve come un surrogato della membrana a doppio strato lipidico che racchiudono endo-vescicole lisosomiali. Questo modello generalizzabile è stato utilizzato da altri per valutare il comportamento endosomolytic di penetrazione cellulare peptidi e altri sistemi polimerici consegna del gene. 8-11 In questo esperimento, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che mimano extracellulari (7.4), precoce endosomali (6.8), e la fine del endo-lisosomiale (&lt;6.8) ambienti. La quantità di emoglobina rilasciata durante il periodo di incubazione è quantificato come misura di lisi dei globuli rossi, che viene normalizzato alla quantità di emoglobina rilasciata in campioni di controllo positivi lisate con un detergente. Da screening di una piccola libreria di materiali di prova potenzialmente endosomolytic, si può dedurre che i campioni che non producono emolisi a pH 7.4, ma orlo significativamente elevatiolysis a pH &lt;6.5, saranno i candidati più efficaci e cytocompatible per la consegna della droga citosolico. Materiali che soddisfano questi criteri dovrebbe rimanere inerte e non indiscriminatamente distruggere le membrane a doppio strato lipidico (cioè che potrebbe causare citotossicità) fino ad essere esposto ad una diminuzione del pH locale dopo interiorizzazione in endo-compartimenti lisosomiali. In questo protocollo, eritrociti sono isolati da un donatore umano e co-incubate a pH 5,6, 6,2, 6,8, 7,4 o con agenti farmaci sperimentali endosomolytic consegna. Eritrociti intatti sono pellettizzati, ei surnatanti (contenenti emoglobina rilasciata da eritrociti lisati) vengono analizzati per l&#39;assorbanza caratteristica di emoglobina mediante un lettore di piastre (Figura 1).

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-253-145 </td><td> Per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer sangue aghi di raccolta, 20,5 scartamento </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-665-31 </td><td> Per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer tubo porta / ago Adattatore </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-289-953 </td><td> Per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td> BD Marca isopropilico tamponi imbevuti di alcool </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-680-63 </td><td> Per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-657-6 </td><td> Per la raccolta del sangue </td&gt; </tr><tr><td> Acido cloridrico (conc.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td> Per la regolazione del pH del D-PBS. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td> Controllo positivo </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene MF75 sterile monouso Bottle-Top Unità Filtro con membrana SFCA </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-740-44A </td><td></td></tr><tr><td> BD piastre a 96 pozzetti, a fondo piatto, di coltura trattata con polistirolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-2C </td><td> Per piastra di lettura al termine del saggio. </td></tr><tr><td> BD piastre a 96 pozzetti, fondo tondo, di coltura trattata con polistirolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-17 </td><td> Per incubazione di globuli rossi con agenti sperimentali. </td></tr></table&gt;

ex vivo blood red emolisi test cellulare per la valutazione degli agenti endosomolytic ph-sensibile per la consegna dei farmaci citosolico biomacromolecular

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Doppi strati di fosfolipidi che costituiscono endo-lisosomiale vescicole possono rappresentare un ostacolo alla consegna di farmaci biologici a bersagli intracellulari. Per superare questo ostacolo, una serie di trasportatori di farmaci sintetici sono stati progettati per interrompere attivamente la membrana endosomiale e consegnare cargo nel citoplasma. Qui, descriviamo il saggio emolisi, che può essere usato come un rapido, ad alta resa per la schermata citocompatibilità e attività endosomolytic dei sistemi intracellulari drug delivery. Nel saggio emolisi, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che imitano extracellulari, endosomali precoce e tardiva endo-lisosomiali ambienti. A seguito di una fase di centrifugazione a pellet intatti cellule rosse del sangue, la quantità di emoglobina rilasciata nel terreno viene misurata spettrofotometricamente (405 nm per migliore dinamica). Il rosso per cento rottura delle cellule del sangue viene poi quantificato rispetto al controllo positivo samples lisate con un detergente. In questo sistema modello la membrana eritrocitaria funge da surrogato per la membrana lipidica a due strati che racchiudono endo-lisosomiale vescicole. Il risultato desiderato è emolisi trascurabile a pH fisiologico (7,4) ed emolisi robusta in endo-lisosomiale intervallo di pH da circa pH 5-6,8.

<html> In genere, gli agenti che presentano ideale pH-dipendente comportamento emolitica hanno il più alto potenziale per la consegna citosolico di farmaci, acidi nucleici, o altre molecole bioattive. Questo è esemplificato da Agent # 1 come rappresentato in figura 2, che presenta emolisi minima a pH 7,4, ma un forte aumento comportamento emolitica a intervalli di pH endosomiali (&lt;6,5). Alcuni agenti possono esibire livelli significativi di comportamento emolitica a intervalli di pH fisiologici (Agent...

Un saggio di emolisi può essere usato come un rapido, ad alta resa di schermo citocompatibilità sistemi di rilascio di farmaci e l&#39;attività endosomolytic per la consegna del carico intracellulare. Il saggio misura la rottura di membrane eritrocitarie in funzione del pH.

Ex Vivo Blood Red emolisi test cellulare per la valutazione degli agenti Endosomolytic pH-sensibile per la consegna dei farmaci citosolico Biomacromolecular

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare quantitativamente il potenziale di perturbazione della membrana di vettori per il rilascio di farmaci destinati al trasporto intracellulare di biologici, utilizzando globuli rossi come modello biologico della membrana endosomiale. Questo video è stato prodotto dal laboratorio di terapie avanzate della Vanderbilt University. Tutte le procedure che coinvolgono soggetti umani sono state approvate dal comitato etico istituzionale della Vanderbilt.Prima di tutto, una breve introduzione all'endocitosi, all'emolisi e all'emolisi. I vettori di prodotti biologici vengono internalizzati nelle cellule all'interno di endosomi mediante endocitosi non specifica o mediata da recettori. Successivamente all'endocitosi.Il carico viene degradato nei lisosomi oppure trasportato per l'esocitosi nuovamente nello spazio extracellulare. Come mostrato, tuttavia, la diminuzione del pH in un endosoma può essere sfruttata mediante vettori farmacologici sensibili al pH che, in risposta all'ambiente acido, diventano in grado di alterare la membrana, creando pori fisici e/o destabilizzando la membrana endosomiale; una volta che l'endosoma è alterato, il farma

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Questo video descrive un test in vitro per determinare l'emolisi indotta da calcio-ionoforo o la lisi dei globuli rossi in un campione umano. Il test misura la percentuale di emolisi quantificando l'emoglobina rilasciata dagli eritrociti rotti.

Saggio di emolisi: un metodo in vitro per misurare la lisi indotta da ionoforo di calcio negli eritrociti umani

In questo video, dimostriamo il test di legame dell'annessina V per misurare il grado di eriptosi, la morte cellulare programmata degli eritrociti, utilizzando la colorazione fluorescente con annessina V. Gli eritrociti apoptotici dimostrano la traslocazione della fosfatidilserina dal lembo interno a quello esterno della membrana cellulare, facendo sì che l'annessina V marcata con fluoroforo si leghi alla fosfatidilserina traslocata, emettendo così un segnale fluorescente.

Saggio di legame dell'annessina V: una tecnica basata sulla fluorescenza per identificare gli eritrociti apoptotici tramite marcatura della fosfatidilserina

Questo video mostra un test per studiare l'efficienza di richiusura della membrana plasmatica nelle cellule di mammifero. Le cellule sono esposte a una tossina batterica che forma i pori nella membrana cellulare. In presenza di ioni calcio extracellulari, il poro provoca l'afflusso di calcio, inducendo eventi di richiusura della membrana. L'efficienza di richiusura viene valutata utilizzando il colorante allo ioduro di propidio legante il DNA, che entra nelle cellule solo senza una membrana...

Un test in vitro basato sulla fluorescenza per misurare l'efficienza di risigillatura della membrana plasmatica

Per somministrare farmaci antitumorali ai siti tumorali con elevata specificità ed effetti collaterali ridotti, sono necessari nuovi metodi basati su nanoparticelle. Qui, descriviamo micelle reticolate disolfuro che possono essere facilmente preparate mediante ossidazione mediata da perossido di idrogeno e sono in grado di dissociarsi in modo efficiente in un ambiente tumorale riducente per rilasciare carichi utili.

Un approccio Facile ed efficiente per la produzione di micelle reversibile Disulfide Croce-linked

È stato sviluppato un test in tempo reale ad alta produttività per identificare contemporaneamente (1) antimicrobici penetranti nelle cellule eucariotiche che prendono di mira un patogeno batterico intracellulare e (2) valutare la citotossicità delle cellule eucariotiche. Una variante della stessa tecnologia è stata successivamente combinata con la tecnologia di dispensazione digitale per consentire studi di sinergia facili, ad alta risoluzione, dose-risposta e bidimensionali e tridimensionali.

High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

mitocondri delle cellule endoteliali sono fondamentali per mantenere l'integrità del sangue-cervello barriera. Introduciamo un protocollo per misurare la funzione bioenergetico nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali.

Valutazione della funzione bioenergetica in cellule endoteliali vascolare cerebrale

Questo documento presenta un flusso di lavoro di microscopia ad alto contenuto per la quantificazione simultanea dei livelli ROS intracellulari, nonché il potenziale e la morfologia della membrana mitocondriale - definiti congiuntamente come morfofunzione mitocondriale - nelle cellule adesive viventi utilizzando le molecole reporter fluorescenti per cellule permeanti 5- 6) clorometil-2 ', 7'-diclorodidro-fluoresceina diacetato, acetil estere (CM-H 2 DCFDA) e tetrametilrodamina metilestere...

Profilatura cellulare Redox usando la microscopia ad alto contenuto

Fagosoma, la rimozione fagocitica delle cellule apoptotiche, è necessaria per mantenere l'omeostasi ed è facilitata dalla recettori e vie di segnalazione che consentono il riconoscimento, il engulfment e interiorizzazione delle cellule apoptotiche. Qui, presentiamo un protocollo di microscopia di fluorescenza per la quantificazione del fagosoma e l'attività delle vie di segnalazione efferocytic.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Viene fornito un protocollo per l'induzione dell'eriptosi, la morte cellulare programmata negli eritrociti, utilizzando l'ionoforo di calcio, la ionomycina. L'eryptosi di successo viene valutata monitorando la fosfatidilaserina di localizzazione nel foglietto illustrativo esterno della membrana. Sono stati esaminati i fattori che influiscono sul successo del protocollo e sono state fornite condizioni ottimali.

Induzione dell'eriptosi nei globuli rossi utilizzando un ionoforo di calcio

Il protocollo descrive un saggio rapido, ad alta produttività, affidabile, economico e imparziale per determinare in modo efficiente la vitalità cellulare. Questo saggio è particolarmente utile quando i mitocondri delle cellule sono stati danneggiati, il che interferisce con altri saggi. Il saggio utilizza il conteggio automatizzato delle celle macchiate con due coloranti nucleari: Hoechst 33342 e propidium ioduro.

Un saggio di colorazione nucleare differenziale automatizzato per una determinazione accurata della citotossicità mitocana

Questo protocollo illustra un test di transcitosi delle cellule endoteliali in vitro come modello per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna misurando la capacità delle cellule endoteliali microvascolari retiniche umane di trasportare la perossidasi di rafano attraverso le cellule nei processi di trasporto transcellulare mediati da caveole.

Saggio di transcitosi delle cellule endoteliali come modello in vitro per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna

Scopri il test di emolisi su globuli rossi per valutare vettori di drug delivery pH-sensibili. Questo metodo quantifica la potenziale rottura della membrana endosomica per migliorare la consegna intracellulare di farmaci biologici.

Ex Vivo Blood Red emolisi test cellulare per la valutazione degli agenti Endosomolytic pH-sensibile per la consegna dei farmaci citosolico Biomacromolecular (Video) | JoVE Journal

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