Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Общая цель этой процедуры заключается в оценке миогенного потенциала индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из мышечных предшественников в мышиных моделях острой и хронической регенерации мышц. Это достигается путем предварительной оценки миогенного потенциала клеток in vitro. Вторым шагом является трансплантация клеток с помощью внутримышечной инъекции.

В качестве альтернативы клетки вводятся в бедренную артерию с помощью микрохирургической процедуры. Заключительным этапом является оценка функционального улучшения дистрофического фенотипа обработанных животных. В конечном счете, иммунофлуоресцентные и гистологические анализы используются для того, чтобы показать приживление и функциональный вклад донорских клеток в мышцы хозяина.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенерации скелетных мышц, такие как исследование подходов к клеточной терапии. Применение этого метода распространяется на терапию мышечных дистрофий, поскольку он может проложить путь к стратегиям аутологичной клеточной терапии с использованием предшественников DER клеток IPS. Хотя этот метод может дать представление о терапии на основе стволовых клеток, он может быть применен к другим системам, таким как доставка молекул внутримышечно или внутриартиллерно, а также последующий анализ влияния на мышечную функцию и морфологию.

Впервые у нас появилась идея этого метода, когда мы поняли, что культура IPSL может обеспечить метод преодоления некоторых ограничений взрослых стволовых клеток, таких как доступность биопсии тканей и их потенциал роста. Начните с создания стабильной клеточной линии элементов, которые трансдуцируются с помощью тамоксифен-индуцируемого вектора, сверхэкспрессирующего регулятор миогенеза myo D. После покрытия 1%-ным гелем matri и промывки средним семенем, планшет с трансдуцированными клетками и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в питательной среде. Клетки должны достичь слияния через один-два дня.

Когда они будут готовы, добавьте в питательную среду по одному микромоляру для гидрокситамоксифена. Через 24 часа замените питательную среду дифференцировкой. Среду дополняют одним микромоляром для гидрокси тамоксифена.

Ежедневно исследуйте культуры на предмет образования миотрубков и замените половину среды свежей дифференцировкой. Проводите медиум через день, когда культуры будут готовы. Они используются в анализах трансплантации.

Здесь мышей с дистрофией и иммунодефицитом используют для определения степени приживления для внутримышечной трансплантации. Предварительно обработайте животных инъекцией тамоксифена за 24 часа до трансплантации. Клетки также следует предварительно обработать тамоксифеном, добавленным в питательную среду накануне вечером.

В день трансплантации, отделенные трипсином, подсчетом и центрифугой, клетки промывают клетки один раз в PBS перед Resus, суспендируя в свободном кальции и магнии PBS до концентрации 6 клеток на 30 микролитров. После обезболивания животного и дезинфекции кожи найдите переднюю большеберцовую мышцу. Определите точку введения проксимального отдела сухожилия и введите иглу.

Наклоните на два миллиметра ниже этой точки. Введите пять миллиметров иглы под углом 15 градусов относительно большеберцовой кости и медленно вводите клеточную суспензию, одновременно втягивая иглу. Опорожните шприц с двумя миллиметрами иглы, все еще находящейся внутри мышцы.

Будьте осторожны при извлечении иглы из мышцы, чтобы избежать пролития клеточной суспензии через дорожку иглы. После этих же процедур инъекции при гастроанемии выполняются на два миллиметра выше миосухожильного соединения ахиллова сухожилия и четырехглавой мышцы. Фемские инъекции выполняются на два миллиметра выше дистального сухожилия для внутриартериальной трансплантации.

Предварительно обработайте животных и клетки тамоксифеном, как было показано ранее. Когда клетки готовы к трансплантации, их подготавливают так, как было продемонстрировано ранее, за исключением того, что перед центрифугированием их фильтруют. Повторно суспендируйте гранулу в PBS, не содержащем кальция и магния, и добавьте 10% патентованного синего красителя, чтобы обеспечить визуализацию распределения клеточной суспензии.

Осторожно ресуспендируйте клетки в шприце и удалите все пузырьки воздуха перед введением, после анестезии побрейте и продезинфицируйте область, как показано, сделайте разрез на пять-семь миллиметров и локализуйте бедренный пучок. Аккуратно удалите соединительную фасцию, которая покрывает пучок, с помощью щипцов. Затем осторожно отделите бедренную вену и нерв от артерии, аккуратно введя между ними кончик щипцов и постепенно увеличивая отверстие.

Бедренная вена хрупкая. Следите за тем, чтобы не защемить его во время отслоения от бедренной артерии. После отделения поднимите артерию одним кончиком щипцов и зажмите артерию другим кончиком.

С помощью иглы 30 G проколите артерию и введите 50 микролитров клеточной суспензии ниже по потоку от зажатой области со скоростью инфузии примерно пять микролитров в секунду. Медленно удалите иглу и щипцы из артерии, чтобы восстановить приток крови к конечности. Надавите стерильной марлей, чтобы избежать кровотечения, и/при необходимости прижгите.

Патентованный синий краситель позволяет немедленно распознать правильно сделанную инъекцию, при правильном введении вся конечность быстро станет светло-голубой, зашить рану и наблюдать за животными до тех пор, пока они не выздоровеют. Вводите анальгезию в течение трех дней и осматривайте рану Ежедневные изменения двигательных возможностей обработанных мышей оцениваются с помощью теста на беговой дорожке. Исходные измерения начинаются примерно за месяц до лечения и используются для оценки улучшения состояния каждого тестируемого животного.

Первым шагом является акклиматизация животных к упражнениям перед тестированием. Для этого установите беговую дорожку на скорость шесть метров в минуту на 10 минут. Повторяйте эту процедуру через день в течение одной недели.

Как только они ознакомятся с устройством, установите наклон на 10 градусов и поместите животных на дорожки беговой дорожки. Включайте беговую дорожку со стартовой скоростью шесть метров в минуту. Осторожно подтолкните любое животное, не желающее начинать упражнение.

Далее запустите таймер и увеличивайте скорость на два метра в минуту каждые две минуты, как только животное поляжет в зоне отдыха более пяти секунд. Не пытаясь снова задействовать беговую дорожку, осторожно коснитесь ее палкой, чтобы стимулировать возобновление упражнения. Мышь считается усталой, если она лежит в зоне отдыха более пяти секунд, не пытаясь снова включить беговую дорожку.

После серии из трех последовательных механических стимулов, по одному каждые пять секунд, запишите производительность каждого животного и повторяйте измерения еженедельно или каждые 10 дней не менее трех раз. Начиная через две недели после трансплантации клеток. Повторите ту же процедуру на обработанных мышах после тестирования.

Через 48 часов после введения четырех гидрокситамоксифенов мио де положительные ядра идентифицируются в элементах, трансдуцированных мио DER в культуре. Как видно здесь.

Через неделю клетки сливаются и дифференцируются в многоядерные миотрубки. При внутримышечной трансплантации в зеркальную модель острой мышечной травмы элементы способствуют результатам регенерации тканей на беговой дорожке. Тест на толерантность к физической нагрузке показал улучшение двигательных возможностей у обработанных мышей после трансплантации.

Анализ трансплантированных мышц ex vivo показывает GFP-положительные области, представляющие степень колонизации IMS в ткани хозяина, тем самым демонстрируя, что донорские клетки трансплантируются в дистрофическую мышцу. Важно отметить, что трансплантированные клетки способны дифференцироваться in vivo, образуя новые скелетные миоволокна. В этом примере показана экспрессия альфа-гликана Sarco от генетически скорректированных IMS к альфа-мышам с нулевым заносом Sarco-гликан

Окрашивание Massen tri chrome выявило уменьшение количества фиброзной ткани в обработанной мышце. После этой процедуры можно использовать такие методы, как тест FreeWheel, анализ Эвана Блю Диопа и механику отдельных волокон или всей мышцы, чтобы ответить на дополнительные вопросы об улучшении произвольной двигательной способности, хрупкости волокон и удельной силы. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как оценить способность к дифференцировке мышц, потенциал трансплантата и функциональную эффективность миогенных предшественников, полученных из клеток IPS, с помощью анализов in vitro, in vivo и ex vivo.