血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色

この手順の全体的な目標は、新生児マウス網膜の血管新生を調査することです。これは、最初に出生後の目を核化することによって達成され、次に3番目のステップの固定剤を適用することは、出生後のマーン網膜を慎重に花びらの形に解剖することであり、最後のステップは網膜血管系を染色することです。最終的に、マウス網膜血管系の可視化は、蛍光染色と共焦点顕微鏡法によって達成されます。

この手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるSimon Tlo博士と、私の研究室の元メンバーであるKathleen Allensonです。この手順全体を通して、デフォルトの温度は室温です。人道的に殺されたネズミの子犬をハサミで横に置くことから始めます。

目を覆っている皮膚を取り除きます。次に、ハサミを目の下に置き、視神経と周辺組織を切って目を持ち上げます。除核した眼球を、2回で4%PFAである固定剤を含む24ウェルプレートに移します。

PBSは、固定剤に1つが入っている間に次の眼の解剖を進めます。2 つの眼の解剖の間のずらしは 30 分になります。練習して。

各目を10〜15分間固定します。次に、氷の上でPBSを2回冷やして少なくとも5〜10分間移します。網膜を分離する前に、イノシシを広げるためにカットされたプラスチック製の牧草地ピペットを使用して、必要なだけ多くの目をPBSに集めます。

解剖顕微鏡下でPBSを2倍含むシャーレに眼球を移します。鉗子やハサミを使って目の周りの脂肪を取り除きます。角膜の端を鋭利なハサミで突き刺し、角膜と虹彩の周りを切り取り、これらの組織を捨てます。

次に、網膜と強膜の間に鉗子を挿入します。網膜を引き裂かないように注意しながら強膜を取り除きます。脈絡膜層は、網膜を損傷するリスクがない限り、除去することもできます。

脈絡膜をそのままにしても、免疫染色の品質に大きな影響はありません。次に、鉗子を使用して、レンズと硝子体液を取り除きます。続いて、房状血管を切除します。

細い鉗子を使用して、目の中心にそれらを集めます。次に、それらを網膜の中心からすばやく引き離します。黄色いアザミをすべて取り除くには、いくつか残しておくと、立っている結果が不明瞭になる可能性があるため、特に注意してください。

カップ型の網膜をきれいなシャーレに移し、PBSできれいにすすいでください。今、網膜に。中心に向かって約3分の2に達する4〜5回の放射状切開を行います。

スプリングハサミを使用して、このペダル型の網膜を作成します。このステップを完璧にするには、忍耐と練習が必要です。次に、牧草地のピペットを使用してPBSのほとんどを引き出します。

これにより、網膜が平らになります。次に、小さな吸収紙で余分なPBSを取り除きます。次に、網膜の表面にマイナス20度のメタノールを一滴ずつ塗布し、ほとんどが水没するまで塗布し、その後、メタノールをたっぷりと加えます。

網膜が白くなります。このステップは、網膜を固定するのに役立ち、浸透を促進します。冷たいメタノール中の網膜を小さなチューブに移します。

広口径のプラスチックピペットを使用。必要に応じて、冷たいメタノールで少なくとも20分間インキュベートすると、網膜はマイナス20度でメタノールに数ヶ月間留まることができます。抗体はここでのみ使用します。

シネは、母親の固定網膜にうまく使用できません。.この場合、網膜は花びらの形に平らにした後、直接免疫染色に進む必要があります。まず、網膜からメタノールを慎重にピペッティングします。

次に、網膜をPBSの1倍ですばやく優しくすすぎます。PBSを取り外し、適切な血清の5%を含む100マイクロリットルのパーマブロック溶液で網膜を覆います。.網膜を1時間後に静かに振るように設定します。

パーマブロック液をピペットで取り出し、一次抗体またはセレクチン剤を含む100マイクロリットルのパーマブロック液と交換してください。次に、網膜を摂氏4度で一晩インキュベートし、翌朝に揺さぶるように設定します。網膜をPBS TXで4回、1回の洗浄につき10分間洗浄します。

すべての洗浄ステップで穏やかに揺り動かします。一次抗体が非標識の場合は、PBS txで1〜200に希釈した適切な蛍光二次抗体100マイクロリットルを添加します。網膜を摂氏4度で一晩または室温で4時間インキュベートし、穏やかに攪拌して二次抗体を除去します。

PBS TXで網膜を4回、1回の洗浄で15分間穏やかに揺らします。次に、マウントを進めます。広口径のプラスチックピペットを使用して網膜をスライドに移し、ティッシュで余分なP-B-S-T-Xを取り除きます。

次に、網膜を50マイクロリットルの長期金に取り付け、溶液をカバースリップで優しく覆います。ゴールドデセットを長引かせるには、スライドを摂氏4度で一晩冷蔵し、翌日は光から保護します。解剖後の網膜のイメージングを進めます。

網膜は、ISOセレクチンB 4 Alexa 4 88を使用して平らな花のように見えるはずです。内皮細胞は染色され、緑色に見えます。Antifa平滑筋を用いて支持する血管筋細胞を可視化し、アクチンを5倍の対物レンズを用いてローパワービューで可視化し、抗体の異なる組み合わせを用いて網膜の血管組織を概観することを可能にした。

内皮細胞は、抗CD 31免疫染色を使用して観察でき、NG 2に対する抗体を使用して視覚化された寄生虫をサポートします。あるいは、支持寄生虫を抗デスミンで染色しました。抗デスミン染色は、寄生虫の指のようなプロセスを視覚化し、寄生虫が内皮細胞と密接に関連しているかどうかを判断するのに役立ちます。

対照的に、抗NG 2染色は各寄生虫の核の輪郭を描くため、血管系内の寄生虫細胞の数を定量化する際に有用です。この手順を試みるときは、解剖ツールで網膜表面に触れたり損傷したりしないように注意することが重要です。この手順に続いて、特定の細胞の増殖を調べるために、BD染色などの他の方法を実行できます。