Name: 使用自动 3D 跟踪系统记录成年斑马鱼的个体和成群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: 了解自动三维跟踪系统如何记录成年斑马鱼个体与群体的运动轨迹。该方法采用多视角高速成像与折射校正算法，可精确分析运动学、空间分布及社会行为特征，为神经科学研究提供可靠的行为学分析工具。

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作者没有致谢。

所有实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。
1. 校准
<ol>
	<li>将一个空的观察容器放入腔室中，使容器的支脚插入用于准确定位的孔内。调整容器方向，使其半透明壁面（该结构的作用是减少反射）朝向相机的远端和右侧。</li>
	<li>打开 记录模块，选择“Camera control”并调整“gain”和“shutter”（取消选中右侧的复选框），使图像清晰。将侧镜以约45°角放置在观察容器的左侧，确保计算机显示器上容器的侧面视图完全可见。此外，需调整镜面角度，使容器的前壁在图像中呈现为一条直线（如箭头所示） 图3).</li>
	<li>将校准面板连接至并行端口（相机卡的端口），然后按下“LED 面板开/关”按钮 记录模块 打开LED灯。</li>
	<li>将校准面板放入空的观察容器中，使计算机显示器上的前方、顶部和侧面视图均可看到5个LED。 图3 （有时电缆会遮挡视野，此时应将其移开）。还需确保LED灯位于水位标记线以下（这些标记线刻在观察容器内壁，距容器底部内侧135 mm处），并确保面板位置稳定（以免在1.9步骤加水时发生移动）。</li>
	<li>关闭观察室的灯光并拉上窗帘（注意不要触碰校准板的电缆或侧镜）。</li>
	<li>点击“数据存储位置”按钮，创建或选择一个用于保存校准文件的文件夹。这些文件将在后续所有记录（或实验）中使用，直至需要重新校准为止。因此，建议将校准数据的相关信息纳入校准文件夹的名称中。</li>
	<li>调整计算机屏幕上的三个红色方框，使每个方框恰好包含任意一个视图中的5个LED图4，左侧面板）。再次使用“Camera control”（相机控制）下的“gain”（增益）和“shutter”（快门）设置，获得LED的清晰图像，且无其他光点的成像（这些光点由噪声、容器壁上的反射或水滴引起），如 图 4，右侧面板。</li>
	<li>关闭LED，然后点击“Collect calibration w/o water”按钮。计算机屏幕上会出现5个标有编号0-4的标签（'x'）。打开面板电源，标签的位置应与LED位置重合。若不重合，请重复步骤1.7（参见 图4 左侧面板展示标签分配错误的情况，右侧面板展示标签分配正确的情况。</li>
	<li>将观察室注水至标记处。LED 应位于水面以下（如步骤 1.4 中所述）。若 LED 处于水位以上，请排空容器并返回步骤 1.4。向容器注水时，需注意避免 LED 面板移动；若发生移动，应排空容器并返回步骤 1.4。此操作至关重要，因为校准过程依赖于测定有水和无水条件下所记录的 LED 位置差异。</li>
	<li>点击“Collect calibration w. water”按钮。与步骤1.8类似，屏幕上将再次出现五个标记，这些标记的位置在大多数情况下会与无水校准所得的位置略有偏移。在此步骤中，可能需要重新调整增益（gain）和快门（shutter）参数。重复操作，直至标记准确地位于LED上方（如同 图 4，右侧面板）。</li>
	<li>打开观察室的灯光，调节增益和快门（在“相机控制”下），使图像不过度明亮。</li>
	<li>图5 显示需依次通过鼠标右键选择的六个点。确保这些点位于指定的线上：1. 正视图中的水位线，2. 俯视图中容器左上边缘，3. 侧视图中勾勒前壁的垂直线。直线的长度并不重要。在点击第1与第2点、第3与第4点、第5与第6点之间时，将自动显示直线（屏幕上实际不会显示数字）。点击“采集容器信息”以保存该数据。</li>
	<li>移除两侧的反光镜和LED面板，将水加至刻度线处。选择“开始录制”，新窗口将提示输入持续时间（分钟），当前目的下1分钟已足够，点击“确定”。</li>
	<li>记录完成后，退出 记录模块，开放 轨迹模块选择校准文件夹（在步骤1.6中创建），使用“Data Location”进行加载（文件加载可能需要一些时间）。该文件夹包含校准文件以及刚刚记录的数据文件（步骤1.13）。</li>
	<li>点击“采集背景”按钮。新窗口将打开，无需更改任何设置，直接点击“确定”。等待观察罐的（倒置的）图像出现在显示器上。然后点击“加载背景”，背景图像将被校正。随后会弹出一个要求调整框体的新窗口，直接点击“确定”即可。</li>
	<li>依次按下第三至第七个按钮：“加载无水对应点”、“校准虚拟相机”、“加载折射对应点”、“采集容器几何形状”、“获取动物容器信息”。最后一步可能需要数分钟，当屏幕上出现三条白线（即步骤1.12中绘制的线条）时，表示该步骤完成。按下 &#34;保存容器信息&#34; 按钮</li>
	<li>点击“收集体积”按钮。现在，如图所示 图6依次标记水体的8个角，该水体为一个长方体。每个点需先在前视图中单击，再在顶视图中单击。</li>
	<li>在窗口左上角选择“3D”。此时将弹出一个新窗口，显示一个底部为白色的立方体轮廓（如 图15，但不显示轨迹）。右键单击鼠标以选择盒子视图的旋转和平移。如果未显示图像，或图像不是长方体的形状（即. 在步骤1.17中，若角点右键单击的顺序错误，则执行以下操作：离开但不关闭 轨迹模块，使用 Windows 系统时，进入校准文件夹（步骤 1.6 中创建），选择子文件夹“Animal container data”，删除名为 TankVertices 的文件，并重复步骤 1.17。</li>
	<li>祝贺，校准已完成。理想情况下，应使用模拟鱼进行一次测试运行，以检查所有设备是否正常工作。好消息是，只有当反射镜或相机的位置发生（即使轻微）改变，或出现追踪问题时（参见第3节），才需要重新进行校准。</li>
</ol>
2. 记录
<ol>
	<li>将装水至刻度线的观察容器放入观察室中，使容器的支脚插入用于准确定位的孔内。从摄像头视角观察，调整容器方向，使半透明壁（或本例中的白色壁——参见讨论部分）朝向远离摄像头的一侧及右侧。</li>
	<li>打开隔间内的光源，将（实验用或模拟）鱼放入容器中，并关闭窗帘。注意：该系统可同时记录多条鱼（参见代表性结果部分）；但建议先通过记录单条鱼来积累对该系统的使用经验。</li>
	<li>打开记录模块，屏幕上将显示容器的正面和顶部（镜像）视图。图像可能不够理想（例如，曝光过度，例如 图7），需进行调整（接下来的三个步骤），以获得鱼体与背景之间的良好对比度（例如 图8）。</li>
	<li>选择“相机控制”，在弹出的“常规设置”窗口中，取消选中右侧对应的复选框（参见 图9），然后调节“快门”和“增益”参数，使图像不出现过曝，并确保鱼体与背景之间具有良好的对比度。</li>
	<li>在“相机控制”窗口左侧选择“白平衡/颜色”，在新窗口中取消选中“自动”选项，并调节红色和蓝色数值（参见 图10），以在正面和顶部视图中均获得最佳的颜色对比度。</li>
	<li>可能需要多次交替调整“白平衡/颜色”下的色彩设置与“常规设置”下的增益和快门参数，以获得最佳的相机配置。请注意，即使您认为无需调整也已满意，也必须取消选中“快门”、“增益”和“自动”选项（如步骤2.4和2.5所述），否则在录制过程中背景会发生波动，导致无法提取运动轨迹。请勿更改其他任何设置。完成后关闭“相机控制”窗口。</li>
	<li>在记录模块的主菜单中选择“数据位置”，以创建或打开先前建立的文件夹。请注意，每次录制（例如 单条鱼或鱼群）都会生成独立的文件夹，理想情况下应为实验主文件夹的子文件夹。</li>
	<li>点击“开始录制”，弹出窗口要求输入录制时长（单位为分钟，仅输入整数）。点击“确定”后，即开始实际录制。</li>
	<li>若录制完成，请退出程序。在录制下一条鱼之前，建议重启计算机。使用Windows中的重启选项，以保留之前设置的相机参数（步骤2.4和2.5）。两次录制之间需要重启计算机，是由于相机卡存在某些技术问题。</li>
	<li>在进入轨迹模块进行路径重建之前，需将校准文件夹（本方案第一部分创建）中的“动物容器数据”和“对应数据”两个子文件夹复制并粘贴至每个录制过程中生成的文件夹中。这些文件夹内还包含另外两个子文件夹：“原始数据”和“时间戳”。“原始数据”包含所有以JPEG格式存储的录制帧图像；“时间戳”则记录了总帧数及帧间间隔（单位为毫秒）。</li>
</ol>
3. 路径重建
<ol>
	<li>打开 轨迹模块，按“数据位置”以选择使用创建的文件夹 记录模块 然后按下“System Setup”按钮以打开“Parameters”（参见 图11).</li>
	<li>选择顶部和底部的视图颜色阈值。一个合适的起始值为 1,000。如果该值过低，软件更有可能记录噪声；但如果该值过高，鱼类可能低于检测范围。后续步骤（3.11 和 3.12）中可能需要重新调整颜色阈值。还需注意，顶部和底部的颜色阈值不必相同。</li>
	<li>选择顶部和底部视图的大小阈值。对于中等体型的斑马鱼，合适的起始值为10；体型较大的可设为20，体型非常小的则设为5。大小阈值越高，越不容易捕获到噪声信号。然而，若阈值过高，软件也可能无法检测到鱼类。在步骤3.11和3.12中，可能需要重新调整大小阈值。还需注意，顶部和底部的大小阈值不必相同。</li>
	<li>“上尺寸阈值”通常设置为3,000较为合适，“特定长度”保持默认值220即可。“鱼的数量”指观察箱中鱼的数量。“最大点数”指总帧数。请记住（或记录下）此数值或略低一些的数值例如 45,703 可以记作 45,000。点击确定。</li>
	<li>依次按下“加载无水校准数据”、“校准虚拟相机”和“加载动物容器信息”按钮。如果未将校准子文件夹“动物容器数据”和“对应数据”复制到当前实验文件夹中（见步骤2.10），系统将生成错误提示。若出现此情况，请立即复制并粘贴这两个子文件夹，然后重新点击上述按钮。</li>
	<li>按下“采集背景”按钮。新窗口将提示输入“起始”和“终止”值，默认分别为0和100。将100更改为最大帧数（如步骤3.4中的示例，此处可简化为45,000）。点击“确定”。</li>
	<li>等待（扭曲的）图像出现，然后点击“加载背景”，以生成正确的背景图像。在此背景图像中，鱼不应可见。如果鱼仍然可见，请尝试从其他录制片段中获取更合适的背景图像。例如 尝试 0-1,000、1,000-2,000 等等。 在步骤 3.6 中）。</li>
	<li>如果在记录期间鱼完全未移动，则获取背景图像的唯一方法是将鱼移除，然后在不放置鱼的情况下，使用相同的“Camera Controls”设置（这一点很重要）进行一次新的短暂记录。获取背景图像后，将“Background data”子文件夹复制到当前实验文件夹中。然后点击“Load background”，不要点击“Acquire background”。请注意，打开和关闭遮光帘通常会导致背景发生一定程度的变化，因此可能需要调整步骤3.2和3.3中的阈值以减少噪声。步骤3.11展示了如何检查噪声。</li>
	<li>加载背景后，使用鼠标调整三个红色方框，如图所示 图12。方框标示了软件用于检测鱼的区域。关闭左侧的方框（即 将其简化为一条线或一个点，因为侧视图仅用于校准（如步骤1.7所述）。</li>
	<li>点击“开始生成轨迹”按钮。此时会弹出一个窗口，要求输入起始帧编号。使用默认值“0”即可。按下“确定”后，将打开“标签分配”窗口（参见 图13）。按下“逐步前进”，直到屏幕上出现标记（“X0”）。如果标记未放置在鱼的图像上，持续按下“否”，直至标记被正确放置。然后按下“开始”。如果标记始终未被正确分配（或完全未分配），仍请按下“开始”，并查找问题所在（下一步）。</li>
	<li>路径重建开始。理想情况下，标记应始终（或至少大多数情况下）位于鱼的图像上。如果标记经常出现错误，请打开视频屏幕上方第二个选项“信息”窗口。 图14A 显示理想情况，仅可见鱼的轮廓。 图14B 显示了一个噪声过强的案例，这种噪声会妨碍正确的标签分配。如果你看到的是没有噪声的清晰鱼体图像（如 图14A），但如果标签从未或极少被正确分配，则最可能的原因是校准不准确。此时应重新校准并重新进行路径重建。在校准过程中，若未移动镜面和相机，则新的校准数据可用于此前已完成的记录。</li>
	<li>若噪声过大（如 图14B)，在主菜单中点击“停止”，然后选择新的颜色和大小阈值（步骤 3.2 和 3.3）。同时检查红色框体（步骤 3.9）是否可略微缩小（例如以排除水面波动产生的噪声）。注意，有时程序会“卡住”（即完全无法分配标签）：此时应重新启动程序。</li>
	<li>在屏幕上方的第三个选项中观察3D屏幕上的轨迹。 图15. 代表一条轨迹示例。通过鼠标右键点击，可在三维构型的旋转与平移之间进行选择。</li>
	<li>当轨迹绘制完成后，依次点击“保存”按钮（而非“停止”，否则将删除轨迹！）、“轨迹清理”和“轨迹平滑”。此时将弹出一个新窗口，显示用于平滑处理的滤波参数图16）。在未积累更多系统使用经验前，请勿更改默认设置。点击“OK”。</li>
	<li>此时应已明确，为何在录制前选择合适的相机设置（确保鱼与背景之间具有良好的对比度）如此重要（参见步骤 2.4–2.6）。继续进行下一步 数据处理.</li>
</ol>
4. 数据处理
<ol>
	<li>首先，查看用于记录鱼类行为的文件夹（图17）。该文件夹包含从校准文件夹复制而来的“Animal container data”和“Correspondence data”子文件夹，记录过程中生成的“Time stamps”和“Raw data”子文件夹，以及路径重建过程中生成的“Background data”和“Trajectories”子文件夹。</li>
	<li>图17还显示，“Trajectories”子文件夹中包含三个文件。其中 point.smoothed 文件将用于后续的数据处理。在多条鱼同时记录的情况下（例如群游实验），每条鱼都会生成一个独立的 point.smoothed 文件。</li>
	<li>图18展示了一个示例 point.smoothed 文件的开头部分。第一行为样本总数或帧数，第二行为记录时长（以分钟为单位），第三行为相对于摄像机的水体中心坐标（顺序为：x, z, y）。其后每一行对应一帧，列出鱼在该帧的 x、y、z 坐标（单位为 mm）以及该样本的持续时间（单位为秒）。</li>
	<li>处理 point.smoothed 文件中数据的方法有两种：使用数据处理模块，或使用其他软件（如 Excel&#160;或 MATLAB&#160;）进行数据处理模块中尚未（或暂未）集成的计算。</li>
	<li>打开数据处理模块，在工具栏中选择“Project”，然后从下拉菜单中选择“New”，并填写实验名称。再次在工具栏中选择“Edit Project”，从下拉菜单中选择“Add to Project”，然后选择“New group”，并填写组名（例如“Controls”）。注意，目前项目名称和组名称尚未实际使用，但仍需填写。所创建的文件夹可用于存储输出文件（见步骤 4.10）。</li>
	<li>在右侧窗口中选择一个组（例如“Controls”）（见图19），工具栏将发生变化。选择“Edit group”，然后从下拉菜单中选择“Add to group”，再选择“New measurements”，此时将打开文件浏览器。打开记录过程中生成的文件夹（步骤 2.7），选择“trajectories”子文件夹，然后选择 point.smoothed 文件。在图19所示的示例中，Group-A 加载了六个文件，Group-B 加载了四个文件。（注意：在该示例中，平滑处理后的文件扩展名为 0 和 1，因为该实验中同时测试了两条金鱼。）</li>
	<li>进行分析时，在右侧窗口中选择 point.smoothed 文件，选择“Data Processing”，从下拉菜单中选择“Single Endpoints”，并以“Duration freezing”为例（图20）。此时将弹出一个窗口，用于设定冻结行为的速度阈值和持续时间阈值。在示例中，鱼在观察期间有 25.86% 的时间处于冻结状态。</li>
	<li>为熟悉程序操作，可尝试其他示例，如移动距离（Travel distance）、深度分布（Depth Distribution，可用于确定深度层级数量）和爆发频率（Burst frequency）。</li>
	<li>还可进行更高级的计算，例如加速度 z 分量的频谱分析。此时，选择“Time-series features”，然后依次选择“TD freq domain analysis”、“Spectral analysis”和“Z accele spectrum”，将对指定参数执行傅里叶分析（详见文献7）。菜单中显示的部分选项尚未完全实现，例如“Path tortuosity”仅为实验性添加功能。</li>
	<li>当选择“Batch processing using default threshold”选项时，系统将计算约 200 个终点参数。此处“默认”指已设定分界参数。例如，当前深度分布按三个深度层级计算，角分布按四个区域（即象限）计算，等等。参数生成后，将弹出新窗口，提示输入保存文件的位置和名称。这些数据将以 CSV 格式保存，可导入 Excel 等其他软件进行进一步处理。</li>
	<li>与记录模块和轨迹模块不同，数据处理模块是一个持续发展的模块，未来将根据研究人员的需求进一步优化和调整。</li>
</ol>

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</ol>

Hans Maaswinkel、Liqun Zhu 和 Wei Weng 是位于美国纽约州罗纳孔科马的 xyZfish 公司员工，该公司生产了本文所使用的追踪系统。

此处展示的实验流程可用于记录单条斑马鱼、成对斑马鱼（例如用于研究交配或攻击行为）以及斑马鱼群（如代表性示例所示）。该系统特别适用于同时获取有关三维（垂直和水平）分布、运动学特征（例如速度、加速度、转向角）和社会参数（例如社会凝聚力）的信息。以下列出在规划实验时需考虑的一些重要事项。
根据实验方案的不同，可以研究不同的行为系统。例如，为了探究新奇恐惧（即对新环境的恐惧），应在将斑马鱼放入观察水箱后立即开始记录（仅等待数秒，待水体稳定以减少干扰），无需预先适应11,17,37。另一方面，某些研究主题可能需要斑马鱼充分适应环境，例如在研究警戒信息素效应时16。在研究斑马鱼群体时，实验者应意识到，尽管软件可最大程度减少标签切换，但目前尚无法在整个实验过程中持续追踪个体斑马鱼。在侧重于社会聚集性的群聚行为研究中，这一点并不重要，但在研究攻击性或交配行为时则至关重要。手动重新分配标签是一种可行方案，但可能非常耗时。
观察容器和观察室壁的颜色可能对斑马鱼的行为产生显著影响。例如，已有研究描述白色墙壁会引发斑马鱼的厌恶反应。36, 37尝试不同颜色时，需牢记两点：1）前壁（即. 靠近摄像机一侧的壁面需保持透明，且若使用盖子，盖子也必须是透明的；2）选择从未使用过的颜色时，应首先确定斑马鱼与背景之间的对比度是否适合录制。需进行一次测试运行。调整录制时的摄像机设置（增益、快门、红色和蓝色，具体见步骤2.5和2.6）以及轨迹重建的设置（例如颜色和大小阈值（如步骤 3.3、3.5、3.11 和 3.12 中所述）可能产生显著影响。同样，对系统的使用经验将在判断可行性方面起到重要作用。
根据实验目的，可能需要具有不同特性（例如：光谱、强度）的光源。LED灯条可轻松更换。确保光线能够照射到容器的每个部分。
如果实验要求斑马鱼在观察容器中停留数小时，需确保提供通气。可使用夹子将通气管固定在容器右后角。通过计算机屏幕检查夹子是否干扰图像采集。 即确保斑马鱼在任何时候均不被遮挡。在 图2A 和 2B 从顶部视图可以观察到黑色夹子。理想情况下，应在记录前或记录间歇期间提供通气，但记录过程中不应通气，以避免产生噪声。还需注意，开启或关闭强通气可能会惊扰斑马鱼。
如果实验需要将斑马鱼在容器中过夜，建议用透明盖子覆盖观察室，以防止斑马鱼跳出（这是非常常见的现象）。如果在开始记录前不取下盖子（以避免干扰斑马鱼），需考虑以下两点：1）确保光源的镜像反射不会干扰记录；例如 通过调整光源位置或选择几乎不反射光线的盖子；2）需考虑盖子在过夜使用时可能起雾，尤其是在需要同时提供通气的情况下；减少此现象的一种方法是选择带有小孔的盖子。
对于某些实验，可能需要在给予斑马鱼药物之前确定其基础行为。在这种情况下，可以通过管道（类似于上文所述的通气管）在实验阶段之间加入药物。
尽管本文主要关注斑马鱼（Danio rerio）的记录，但该系统当然也可用于记录其他鱼类物种。该系统已被用于研究（幼年）金鱼（Carassius auratus）、虎皮鱼（Barbus tetrazona）和绿剑尾鱼（Xiphophorus helleri）的行为。
最后需要指出的是，观察箱的其他尺寸原则上也是可行的。然而，若使用更大的观察容器，则需要对系统进行重新配置，并在空间分辨率和时间分辨率之间找到良好的平衡。此外，容器的形状必须为长方体。斑马鱼或其他实验对象的数量在理论上没有限制；但随着实验对象数量的增加，标签互换现象会增多。

斑马鱼已成为生物学和药理学研究的重要模型1-3. 追踪单条斑马鱼及斑马鱼群的运动轨迹与空间分布模式具有重要价值。早期研究采用基于记录图像的手动定量方法4现在，二维自动视频追踪系统已得到广泛应用5然而，由于斑马鱼以及许多其他水生和非水生动物在三维空间中运动，人们对三维系统的研究兴趣正在增加6该描述的三维系统最初于2007年发表。7有关技术细节及其他系统的比较，请参见8与其它系统相比，该系统的基本优势在于利用镜面系统获取两个（可选三个）同步且独立的视图，并采用两步校准协议。第一步校准立体系统（由相机和镜面构成）的三维几何结构；第二步校正由光折射引入的非线性误差。在研究水生动物时，若不校正光折射的影响，其造成的误差可能相当显著。其他已发表的系统（包括较新的发展）9省略两步校准程序。有关物体识别、多物体跟踪中的遮挡处理以及抖动噪声的技术细节 等等请参阅原始文献8,9该系统已通过焦虑样行为反应研究的验证10,11，群集行为8,11,12 在斑马鱼中表现出拮抗行为的初步研究13。它还被测试用于其他鱼类物种（金鱼8，剑尾鱼，虎皮鱼）以及小鼠9.
下文将描述系统的校准和使用方案，并以NMDA受体非竞争性拮抗剂MK-801对斑马鱼群集行为影响的实验结果作为代表性示例，展示该系统可获得的数据类型。
无论是在自然环境中还是在水族馆中，斑马鱼通常都会成群游动14。成群行为的偏好似乎取决于多种因素，例如饲养条件、性别以及食物可获得性14,15。有趣的是，当存在潜在危险信号（如警戒信息素16或新异刺激11）时，斑马鱼个体之间的距离会变得更小。因此，成群行为范式也被用于测试抗焦虑药物的效果17。等级支配关系18和社会学习19是斑马鱼行为中引人入胜的方面。由于其高度发达的社会行为特征，斑马鱼也已成为自闭症研究的关注对象20,21。
已有研究报道，MK-801 会改变斑马鱼的社会行为5,22,23，这与其对哺乳动物的影响相似24。然而，MK-801 还会对其他行为产生多种影响（如游泳行为、抑制性回避和位置偏好25-27）。因此，在初始实验中，通过基本观察尽可能获取更多信息至关重要，这将为设计更具针对性的实验提供基础。
记录设备与软件的概览
在当前配置下，用于盛放斑马鱼的观察容器（25 cm × 25 cm × 18 cm，长×宽×高）被放置于观察室（91 cm × 46 cm × 56 cm，长×宽×高）内。观察室内还包含一台相机，以及一面悬挂在约 &#62;容器上方45°角，LED灯条 图1 显示了一个简化示意图。相机同时记录前方视角和顶部视角（镜面反射），通过确定斑马鱼的 x、y 和 z 坐标来构建其三维运动轨迹。为便于确定方向，观察容器左前角（相对于相机的位置）标有坐标矢量，该坐标系与三维视图中所示的矢量相对应例如 图15由路径重建模块（见下文）生成。采样率取决于相机和计算机性能，在我们的实验中约为 40 帧/秒&#160;（帧/秒）。所记录画面的空间分辨率为 640 × 480 像素（该配置在空间分辨率与时间分辨率之间达到了最佳平衡，故被选用）。需要 Windows XP 或更高版本操作系统。
在首次记录之前，必须对系统进行校准，以确定容器壁和水面的位置，确定记录图像的缩放系数，并校正光线从水中进入空气时因折射而产生的显著误差。原则上，校准仅需在初次安装时进行，或在摄像头、镜子等装置部件移动或更换后进行。然而，定期检查校准是否仍然准确，并在必要时重新校准，是一种良好的实验操作规范。
该软件包含三个模块。记录模块用于记录图像帧（图2展示了两个示例帧）。轨迹模块用于重建每条斑马鱼的运动路径。数据处理模块用于计算一系列标准的运动学和空间参数。为便于进一步分析，数据可导入电子表格或统计软件中。

<table><tbody><tr><td>AABT-3D 跟踪硬件</td><td>xyZfish</td><td>AABT II</td><td>包含摄像头、视频采集卡、带反光镜和照明装置的观察室</td></tr><tr><td>AABT-3D 校准设备</td><td>xyZfish</td><td>calib</td><td>包含校准板和侧反光镜</td></tr><tr><td>AABT-3D 观察容器</td><td>xyZfish</td><td>cubes</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>AABT-3D 跟踪软件</td><td>xyZfish</td><td>v.1.0</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>计算机</td><td>可选</td><td>不适用</td><td>Windows XP 或更高版本</td></tr><tr><td>(+)-MK-801 氢马来酸盐</td><td>Sigma</td><td>M107</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>气泵</td><td>Fusion</td><td>500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>气管管路 3/16&amp;rdquo;</td><td>Lee&amp;rsquo;s Aquarium and Pet Products</td><td>14508</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>中型文件夹夹子</td><td>OfficeDepot</td><td>561339</td><td>用于将气管固定在观察容器上</td></tr></tbody></table>

使用自动化三维追踪系统记录成年斑马鱼个体及鱼群行为

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

与许多水生动物一样，斑马鱼（斑马鱼）在三维空间中运动，因此最好使用三维记录系统来研究其行为。本文介绍的自动视频追踪系统通过使用镜面系统和校准程序，校正了光线从水中进入空气时产生的显著误差，从而实现了三维追踪。利用该系统，可记录单条或多条成年斑马鱼的行为。在使用前，系统需进行校准。系统由三个模块组成：记录、路径重建和数据处理。本文提供了校准及使用这三个模块的逐步操作方案。根据实验设置的不同，该系统可用于测试新奇环境恐惧（neophobia）、畏光行为、社会聚集性、运动功能障碍以及新物体探索行为 等等它作为一种初步研究工具，在评估药物或基因突变对基本行为模式影响方面具有特别广阔的前景。该系统可提供斑马鱼在垂直和水平方向上的分布信息，记录运动学参数的xyz分量（如运动、速度、加速度和转向角），并在测试鱼群时提供计算社会凝聚性相关参数所需的数据。

介绍了一种可追踪单条及群体斑马鱼的三维自动视频系统。作为应用示例，我们探讨了NMDA受体拮抗剂MK-801对斑马鱼群行为的影响。

与许多水生动物一样，斑马鱼（Danio rerio）在三维空间中运动。因此，研究其行为时最好使用三维记录系统。

本实验的总体目标是研究斑马鱼或其他水生动物的三维运动模式，并分析其运动学、空间及社会行为特征。该方法可用于检测由基因突变或化学及环境因素引起的异常行为。该目标首先通过系统校准实现，同时校正由折射引起的显著图像畸变。第二步是从至少两个不同角度同时以相对较高的时间分辨率记录视频帧。接下来，软件会重建鱼类的运动轨迹。通过应用先进的算法来减少噪声的影响，并在发生遮挡或聚集时推断鱼类的位置。最后一步是分析数据，并对速度加速度、转向角、观察容器中的水平和垂直分布、个体间距离以及其他感兴趣的参数进行统计分析。最终，高速校准的三维追踪技术可用于研究突变型斑马鱼的行为缺陷，以及药物对多种行为系统的影响。在药物发现方面，该系统的一个优势在于能够研究鱼类在三维空间中的行为。这一点非常重要，因为鱼类在自然状态下会在三个维度中移动，当同时记录多条鱼的行为时，二维记录在研究群体空间构型时可能会产生严重误导。该系统的另一个优势在于能够校正光线折射效应，若不进行校正，可能会导致显著的测量误差。在当前配置下，盛放斑马鱼的观察容器被放置在观察室中。该装置还包含一个摄像头、一面悬挂在容器上方约45度角的镜子以及LED灯条。在开始录制前，需对系统进行校准，以确定容器壁和水面的位置，以及录制画面的缩放系数，同时需校正光线从水进入空气时因折射所产生的误差。校准完成后，应使用模拟鱼进行一次测试运行。如果镜片或摄像头的位置偏移，或出现追踪问题时，应进行重新校准。开始记录前，将装水至标记线处的观察容器放入观察室中，容器的脚应插入对准孔内。将容器摆放至其半透明或不透明的壁面朝向摄像头观察方向的远端和右侧。接着，打开隔间内的灯光，然后将鱼放入容器中并关闭窗帘。打开记录模块，容器的正面和顶面图像将显示在屏幕上。最初获取的图像可能并不理想，因此可能需要进行一些调整，以获得斑马鱼与背景之间足够的对比度。要调整图像，请选择相机控制，然后在打开的常规设置窗口中，取消选中此处所示的复选框，再调整快门速度和增益，使图像不会过曝。接下来，在相机控制窗口的左侧，选择白平衡颜色，在新弹出的窗口中取消选中“自动”选项，并调节红色和蓝色数值，以在正面和顶视图中均获得最佳的颜色对比度。完成调整后，可能需要进行多次调整。从记录模块的主菜单中选择数据位置，以创建或选择一个文件夹。每次记录应拥有其独立的文件夹，该文件夹应为实验文件夹的子文件夹。现在按下开始录制，并输入以分钟为单位的录制时长整数，然后按确定，实验录制会话将开始。录制完成后，将校准文件夹中的动物容器数据和对应数据子文件夹复制并粘贴到录制过程中先前创建的文件夹中。要开始路径重建，请打开软件的轨迹模块，然后按数据位置以选择使用录制模块创建的文件夹。接下来，先按下系统设置按钮以打开参数窗口，调整顶部和底部视图的颜色阈值，建议起始值为1000。然后，选择顶部和底部视图的尺寸阈值。对于中等大小的斑马鱼，建议的初始尺寸为10；对于较大的鱼使用20，较小的鱼则使用5。这些阈值越高，软件检测到噪声的可能性就越低。然而，若数值过高，则可能无法检测到鱼体。在实验的后续阶段，可能需要重新调整这些阈值。对于上限尺寸阈值，通常设置为3000即可。而对于特定长度，保持预设值220不变。鱼的数量是指观察箱中鱼的数量。最大点数是指总帧数，记录或记住此数值，然后按“确定”。接着选择“获取背景”。下一个窗口将提示填写“从”和“至”两个字段。加载背景后，使用鼠标调整三个红色方框，这些方框标示了软件用于寻找鱼类的区域。将左侧的方框调至最小。由于侧视图仅用于校准，现在请按下“开始生成轨迹”按钮，路径重建将随即启动。理想情况下，标签应放置在鱼的图像上；如果标签经常放置错误，请打开信息窗口。在此我们看到一个理想情况，即仅能看到鱼的轮廓。若噪声过多，请在主菜单中按停止，然后选择新的颜色和尺寸阈值。同时，检查红色框是否可略微缩小。例如，在顶部，为排除水流产生的噪声，请观察3D屏幕上的轨迹。通过鼠标右键点击，研究人员可以选择对三维构型进行旋转或平移。要开始数据处理，请打开数据处理模块，在工具栏上选择项目，然后从下拉菜单中选择新建并输入实验名称。接下来，选择编辑项目。然后添加到项目，接着创建新组，并填写实验组名称。现在在右侧窗口中选择该实验组。注意工具栏将发生变化。选择编辑组，然后添加到组，再添加新测量。这将打开一个浏览器窗口。接着，打开录制期间创建的文件夹，并选择其子文件夹“trajectories”，然后选择平滑化点文件。在本示例中，A 组加载了六个文件，B 组加载了四个文件。开始分析时，选择右侧窗口中经过点平滑处理的文件，然后从下拉菜单中选择数据处理和单值终点。例如，选择持续时间冻结。此时将弹出一个窗口，用于通过速度阈值和持续时间阈值来设定冻结参数，以帮助您熟悉该程序。也可以尝试其他示例，如移动距离深度分布，该功能可用于确定深度层级的数量和爆发频率。选择该选项后，系统将在此上下文中使用默认阈值对约 200 个端点进行批量处理。默认值表示已设置分隔符。例如，当前深度分布按三个深度层级进行计算，角分布按四个区段进行计算。生成参数后，将打开一个新窗口，提示输入要创建的文件的保存位置和文件名。这些数据将以 CSV 格式保存，并可导入其他软件中。此处，图 A 显示了对照组的一个典型示例图像。斑马鱼，而图B显示了在上午记录时段内用MK 801处理的斑马鱼的典型示例帧。请注意，对照组斑马鱼靠近底部且彼此靠近；相比之下，经MK 801处理的斑马鱼则靠近顶部，并彼此相距较远地游动。此处展示了对照组斑马鱼和经10微摩尔MK 801处理的斑马鱼在上午和下午两个时段的两条代表性运动轨迹。图中显示了对照组和经10微摩尔MK 801处理的斑马鱼在这两个时段的平均社会距离，此处还展示了两组个体间平均距离随时间变化的时间线。在图A中，我们看到斑马鱼在上午时段于10个相等水深层次中的分布情况，而在图B中则是下午时段的分布情况。此处展示了实验组在四个径向区域中的时间分布。插图显示了这些区域从中心到外围的位置，此处我们还看到实验组在四个象限中的时间分布。插图显示了象限的位置。双线表示白色墙壁，单线表示透明墙壁。摄像头位于插图左侧，靠近第一和第四象限。黑色星号表示上午组间的比较，灰色星号表示下午组间的比较。最后，此处展示了斑马鱼在上午和下午各时段移动距离的 X、Y、Z 分量。数据以均值和标准误表示。使用该系统时，请记住，数据质量完全取决于记录效果，因此务必确保系统经过良好校准，并且相机设置处于最佳状态。其余操作较为简单，只需熟悉各个步骤即可。

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