Imaging cellulare dal vivo di Alphaherpes Virus Trasporti anterograda e Diffusione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare gli eventi di trasporto e diffusione del virus dell'herpes utilizzando fusioni di proteine fluorescenti in colture neuronali primarie. Ciò si ottiene stabilendo prima l'incubazione del campione a temperature fisiologicamente rilevanti su un microscopio in grado di commutare rapidamente l'illuminazione fluorescente. Nella seconda fase, i parametri dell'imaging a fluorescenza sono impostati per limitare eventuali danni alle foto cellulari acquisendo dati ragionevoli.

Successivamente, viene eseguita l'acquisizione sequenziale dei canali fluorescenti o multiposizione. I fotogrammi affiancati multi-immagine vengono acquisiti nella fase finale. I dati vengono analizzati e riformattati per la presentazione e la pubblicazione.

In definitiva, questo metodo di imaging di cellule vive viene utilizzato per tracciare il movimento delle particelle virali fluorescenti all'interno dei neuroni e per seguire l'infezione mentre si diffonde tra le cellule. Questo metodo può fornire informazioni sul trasporto e la diffusione dei neuroni del virus dell'herpes. Può anche essere applicato ad altri eventi dinamici in biologia cellulare e microbiologia, come l'assorbimento endocitico di particelle o la migrazione cellulare.

Prima di qualsiasi esperimento di imaging, collegare e iniziare a riscaldare l'incubatore superiore del tavolino del microscopio. Dopo 30 minuti, accendere il microscopio, le sorgenti luminose trasmesse ed epifluorescenti e i controlli hardware automatizzati. Quindi apri NIS elements, il software di controllo del microscopio per connetterti al microscopio.

Qui viene visualizzata una schermata di un'interfaccia utente standard negli elementi NIS. I pulsanti di riproduzione e arresto controllano la finestra dell'immagine dal vivo che rappresenta le configurazioni hardware correnti per l'imaging, nonché ciò che è attualmente in fase di ripresa. Sul pannello superiore sono presenti una serie di configurazioni ottiche che implementano le impostazioni hardware preimpostate per configurare il microscopio per il rilevamento transilluminato o a fluorescenza.

Il controllo della telecamera e le impostazioni dell'esposizione consentono di configurare il rilevamento della telecamera per ottimizzare la qualità e la velocità dell'immagine. Tutti gli esperimenti sono coordinati utilizzando i controlli di acquisizione ND. Quindi, collegare uno scaldalenti all'obiettivo a immersione in olio appropriato, quindi collegare l'incubatrice superiore al tavolino motorizzato del microscopio.

Assicurarsi che sia posizionato l'inserto appropriato che tratterrà il campione, quindi collegare l'aria umidificata dal controllo dell'incubatore alla porta di ingresso sull'incubatore superiore del tavolino. Accendere l'incubatrice e prestare controlli più caldi, quindi regolare le impostazioni della temperatura in base alle condizioni specifiche precedentemente verificate per l'obiettivo e il campione da riprendere. Infine, aprire la valvola di controllo sul serbatoio atmosferico al 5% di anidride carbonica al 95% per fornire aria integrata con anidride carbonica all'incubatore superiore del palco.

Per inserire un'immagine di un grado di trasporto del virione in tempo reale. Innanzitutto, inserire una piastra di coltura cellulare contenente neuroni infetti nell'incubatore superiore del palco per un minimo di 10 minuti prima di eseguire l'esperimento. Quindi, utilizzando la luce trasmessa e l'oculare del microscopio, trova un corpo cellulare neuronale che ha un'estensione assonale chiaramente isolata.

Trovare aree visualizzabili nella cultura neurale è la parte più difficile di questa procedura. Il successo è assicurato posizionando più colture in caso di scarsa crescita cellulare o infezione, o interrompendo fisicamente la coltura durante l'imaging. Ora usa il software del microscopio per cambiare il percorso della luce verso la telecamera CCD EM, quindi fai clic sul pulsante di riproduzione per avviare una finestra di immagine dal vivo.

Dopo aver determinato le impostazioni ottimali di esposizione della fotocamera per ciascun set di proteine fluorescenti, il guadagno di moltiplicazione elettronica della fotocamera a 300. Per ridurre al minimo il tempo di esposizione e migliorare il rilevamento di segnali deboli. Arrestare la finestra di imaging in tempo reale per evitare lo sbiancamento del campione.

Successivamente, dopo aver impostato i tempi di esposizione e aver trovato una regione ben definita dell'assone negli elementi NIS, configurare il software per l'acquisizione sequenziale dell'immagine. Aprire il menu a discesa delle applicazioni e selezionare l'applicazione sei D define run experiment application. Nella finestra di acquisizione ND, fare clic sulla scheda del tempo per determinare la frequenza di acquisizione dell'immagine.

Impostare l'intervallo su nessun ritardo e la durata su cinque minuti. Ora fai clic sulla scheda Lambda per selezionare le configurazioni hardware preimpostate utilizzate per l'acquisizione multipla di immagini fluorescenti. Fare clic sulla prima casella, quindi nei menu a discesa successivi selezionare una configurazione hardware appropriata.

Selezionare la casella Salva su file e configurare il percorso e il nome del file di output dell'esperimento. Una volta impostati tutti questi parametri, fare clic sul pulsante Esegui ora per avviare l'esperimento. La velocità di acquisizione dell'immagine è ottimizzata attraverso le impostazioni di esposizione e le dimensioni dell'immagine acquisita.

Utilizzare lo strumento regione di interesse negli elementi NIS per definire la regione di interesse. Selezione di un'area compresa tra il 25 e il 50% dell'area totale dell'immagine per eseguire l'imaging time lapse notturno di eventi di diffusione di un grado. Per prima cosa, posizionare delicatamente il piatto di coltura nell'incubatore superiore del palco.

Dopo esserti assicurato che la posizione dell'obiettivo sia impostata sul lato del piatto, metti lentamente a fuoco l'obiettivo, facendo attenzione che non spinga verso l'alto nel campione. Una volta identificato il campo di messa a fuoco, spostare lentamente l'obiettivo al centro della parabola vicino alla barriera interna, demarcando il lato interno del compartimento dell'assone, facendo attenzione a mantenere la messa a fuoco di profondità e ad evitare di spingere verso l'alto nel campione. Successivamente, circondare i neuroni nel piatto di coltura con circa due millilitri di PBS a 37 gradi Celsius al di fuori dell'anello di teflon per ridurre al minimo la disidratazione del campione e fornire isolamento termico.

Quindi attiva tutti i filtri a densità neutra per limitare l'intensità dell'illuminazione al livello più basso possibile, consentendo l'acquisizione frequente di immagini per lunghi periodi di tempo senza eccessivi danni alle foto. Nella finestra di acquisizione ND, fare clic sulla scheda dell'immagine grande, quindi selezionare un'area composta da cinque per due immagini. Utilizzando una sovrapposizione di stitching del 7% per visualizzare in sequenza più posizioni in parallelo.

Durante il corso del filmato notturno, selezionare la scheda Posizioni XY. Quindi definisci le posizioni che definiranno il punto centrale per ogni grande area dell'immagine. Il punto di messa a fuoco dovrebbe essere il nucleo della cellula, posizionare l'obiettivo in modo tale che si veda un involucro nucleare chiaramente definito per la maggior parte delle cellule.

Quindi fare clic su un loop temporale per testare le impostazioni di esposizione e posizione e valutare le immagini risultanti per la luce trasmessa, l'illuminazione, la messa a fuoco e l'inquadratura. Dopo che tutte le impostazioni sono state verificate e testate, avviare l'esperimento automatizzato facendo clic sul pulsante Esegui ora per esportare i filmati ottenuti durante l'imaging di cellule vive. Innanzitutto, apri il file ND due non elaborato appropriato negli elementi NIS e seleziona la vista del componente diviso.

Per visualizzare i canali fluorescenti desiderati, riprodurre il file a una velocità adeguata. Cinque fotogrammi al secondo sono un buon punto di partenza per la visualizzazione del trasporto veloce per includere un timestamp che rappresenti un orologio in tempo reale durante la riproduzione del filmato. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionare AGGIUNGI informazioni ND.

Nell'angolo in alto a sinistra apparirà un contatore digitale per modificare il timestamp, fare clic con il pulsante destro del mouse sul contatore e selezionare Modifica informazioni ND. Nella finestra pop-up successiva, modificare il testo in modo che rifletta i parametri di imaging pertinenti. Modifica il colore del carattere e la dimensione del testo per maggiore chiarezza.

Quindi vai al menu di modifica e seleziona Crea istantanea della vista per aprire la finestra dell'istantanea della vista per generare un file pronto per l'esportazione RGB a otto bit contenente i canali fluorescenti dell'intero filmato, seleziona Applica a tutti i fotogrammi. Infine, salva il file nel formato A VI per la compatibilità multipiattaforma e imposta la velocità di riproduzione a 200 millisecondi per fotogramma. In questa immagine a contrasto di fase, viene mostrata una coltura rappresentativa, matura, dissociata e superiore dei gangli cervicali o SCG impiegata per l'imaging del trasporto intergrado del virione pseudo virus o PRV 3 48 neuroni infetti esprimono GFPS nine e proteine di fusione della membrana della ciliegia GMM.

In questa figura è dimostrato l'imaging rappresentativo su cellule vive degli assoni SCG a otto ore dall'infezione con P RV 3 48 Le strutture di trasporto anterogrado all'interno degli assoni distali sono visualizzate in due canali fluorescenti, GFP e mCherry. Una struttura di trasporto anterograda, come indicato dalle frecce bianche, progredisce all'interno dell'assone. Le due proteine fluorescenti sono spazialmente sfalsate a causa dell'acquisizione sequenziale dei canali fluorescenti e del rapido movimento delle strutture virali.

L'applicazione di questo protocollo alle infezioni di colture dissociate di SCG con PRV 3 48 ha facilitato la visualizzazione del trasporto anterogrado di Vons. L'incorporazione di queste proteine di fusione nelle particelle virali provoca la loro rilevazione sui punti di trasporto, come visualizzato dai punti fluorescenti in movimento. Le suddette condizioni di imaging riducono al minimo l'offset di ciascun fluorazione su una particella in movimento durante la commutazione del filtro.

L'utilizzo di ruote portafiltri a commutazione rapida e specchi dicroici multipass accoppiati consente una rapida acquisizione sequenziale di due o più canali fluorescenti a velocità fino a 0,8 fotogrammi al secondo in una finestra di imaging di tre minuti. Si osservano comunemente numerose Punta trasportatrici e si generano rapidamente campioni di grandi dimensioni per le analisi di colocalizzazione. Qui viene mostrato uno schema del sistema di coltura compartimentalizzato raffigurato in questa immagine con neuroni SCG placcati nel compartimento sinistro e con proiezioni assonali che si estendono sotto le barriere interne nel compartimento all'estrema destra.

Le seguenti immagini sono state selezionate da un filmato time-lapse a piastrelle di grandi dimensioni della trasmissione del virione da PRV 4 27 assoni infetti alle cellule epiteliali riceventi . In questo primo pannello è emersa l'immagine delle immagini fluorescenti YFP e RFP trasmesse in un momento successivo all'infezione. Quando le cellule riceventi iniziano ad esprimere una membrana legata alla membrana, vengono mostrate le proteine di fusione MRFP di YFP e VP 26.

La casella bianca evidenzia un'area delle cellule epiteliali riceventi contenenti assemblaggi di capside infettanti. Qui viene mostrata la stessa area dell'immagine precedente vista solo attraverso il canale RFP. La linea bianca continua denota la rappresentazione schematica del contorno della cella.

Le linee bianche hashed indicano i nuclei cellulari e le linee blu delineano gli assoni. In questo secondo pannello, solo i canali YFP e RFP vengono mostrati insieme. Si noti il gran numero di punti MRFP associati ai tratti assonali.

Queste cellule sono state infettate di recente e non esprimono nessuna delle due proteine di fusione. Le cellule infette possono essere tracciate a ritroso per visualizzare i capsidi fluorescenti che hanno avviato l'infezione virale. Queste singole celle possono essere isolate dal grande fotogramma e tracciate senza una significativa perdita di dettagli.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la microscopia su cellule vive influisce su un processo biologico osservato. Tuttavia, un'attenta ottimizzazione di questi protocolli consente la visualizzazione senza alterazioni.