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이 절차의 전반적인 목표는 멀티플렉스 PCR 분석을 사용하여 메티실린 내성 황색포도상구균 또는 MRSA 분리물의 SCC MEC 유형을 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 물에서 박테리아 세포를 가열하는 것과 관련된 빠르고 간단한 추출 기술을 사용하여 균주에서 DNA를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 각 SEC ME 유형에 특이적인 표적을 증폭하기 위해 멀티플렉스 PCR 분석을 수행하는 것입니다.

다음으로, PCR 산물을 AROS 겔 전기영동에 의해 분리합니다. 마지막 단계는 DNA 및 데이터 분석의 시각화를 위해 겔을 염색하는 것입니다. 궁극적으로, 이 멀티플렉스 PCR 분석으로 얻은 특정 PCR 산물의 고유한 조합은 MRS A 분리물의 SE cmec 유형을 결정하는 데 사용됩니다.이 기술의 주요 장점은 개별 CCR 및 MEC 유전자 복합체를 표적으로 하고 여러 개별 PCR 튜브를 필요로 하는 기존 S CEC 타이핑 체계와 같은 기존 방법에 비해 있습니다. 이 프로세스는 작업 부하를 크게 단순화하고 단일 PCR 튜브에서 수행할 수 있습니다.

이러한 절차는 인증된 생물안전성 레벨 2 실험실에서 수행해야 합니다. PCR을 수행하기 전날에는 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용해야 합니다. 멸균 배양 스틱으로 신선한 하룻밤 플레이트에서 MRSA 단일 콜로니를 선택하고 삼부작 콩 농업 플레이트에 박테리아의 두꺼운 줄무늬를 준비합니다.

여러 샘플을 하나의 플레이트에 줄무늬로 표시하여 섭씨 37도에서 밤새 배양할 수 있습니다. 75마이크로리터의 멸균 증류수를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 멸균 배양 스틱 사용.

하룻밤 동안 무겁게 쏟아지는 박테리아를 소량 흡수하세요. 멸균 된 물에 박테리아를 소용돌이 치면 turid solution을 준비합니다. 모든 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다.

섭씨 95도로 설정된 건조 열 블록에서 튜브를 10분 동안 배양하여 박테리아를 제거하고 DNA를 방출합니다. 열 블록에서 샘플을 제거하고 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오. 13, 1 분 동안 000 RPM에서 샘플을 원심 분리하십시오.

생성된 샘플에는 DNA를 포함하는 세포 파편 펠릿과 투명한 상층액이 있습니다. PCR을 준비하기 위해 영하 20도의 냉동고에서 XPCR 완충액 10개, 염화마그네슘 50밀리몰, DTP 및 프라이머를 포함한 PCR 시약을 제거하고 박테리아나 DNA가 허용되지 않는 깨끗한 PCR 벤치에서 실온에서 해동합니다. 이때 0.2 밀리리터 PCR 튜브를 준비하고 라벨링할 수 있습니다.

일단 와류를 잠시 해동하여 모든 시약을 혼합한 다음 텍스트 프로토콜에서 표 형식으로 결합합니다. 백금 기술 DNA 중합효소를 사용하는 것이 중요한데, 이는 반응의 성공에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌기 때문입니다. 마스터 믹스 Eloqua를 개별 PCR 튜브에 볼텍싱한 후 모든 PCR 튜브를 닫고 일반 작업대로 이동합니다.

이전에 준비된 박테리아 샘플에서 2마이크로리터의 투명한 상등액을 피펫팅하여 PCR 튜브에 템플릿을 추가합니다. 튜브를 열 순환기에 삽입하고 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 반응을 실행하기 전에 전용 증폭 위치로 이동합니다. 유리 삼각 플라스크에서 2.5g의 아가로스에서 100ml의 0.5XTBE 완충액으로 전용 겔 전기영동 위치에서 작업합니다.

플라스크를 플라스틱 랩으로 덮고 완전히 녹을 때까지 전자레인지에서 용액을 끓입니다. 2.5% 젤이 빨리 끓습니다. 따라서 전자 레인지를 중지하고 용액을 정기적으로 휘젓으십시오.

만질 수 있을 때까지 찬물 아래에서 휘젓거나 벤치에서 5분 동안 휴식을 취하여 아그로스를 식힙니다. PCR 열 순환기에서 튜브를 제거한 후 아그로스를 주조 트레이에 붓습니다. 각 샘플에 2마이크로리터의 6개의 XDNA 로딩 염료를 첨가하여 샘플을 준비합니다.

젤에 웰당 5-10마이크로리터의 샘플을 로드합니다. 1KB 플러스 또는 100 염기쌍 DNA ladder는 예상 밴드 크기에 적합합니다. th dium bromide는 붓기 전에 젤에 첨가 할 수 있으며, 또는 대안적으로, gel은 시각화되기 전에 아테륨 브로마이드 욕조에서 염색 될 수 있습니다.

완성된 젤을 밀리리터당 0.5마이크로그램, 브롬화 테륨 및 증류수의 용액에 넣고 셰이커에서 10분 동안 부드럽게 섞습니다. 젤을 깨끗한 용기에 옮기고 증류수에 10분 더 담금니다. 여기에 도시된 것은 SEC MEC 유형 1부터 6 및 8까지의 모든 대표적인 균주와 SEC MEK 4개의 아형 A부터 F까지의 모든 대표적인 균주에 대해 예상되는 PCR 산물을 입증하는 대표적인 겔입니다.

613 염기쌍의 유형 1 특정 밴드와 147 염기쌍의 제어 밴드인 MEC. 3개의 대표적인 SEC MEK 2개의 균주가 나타나며, 그 중 2형은 균주 N 3개, 15 및 덜 널리 퍼진 2형 A 및 2형 B로 균주를 분류하기 위해서는 128개의 염기쌍과 Meca 대조군에서 2형 유전자좌 타겟을 포함하는 2개의 밴드가 존재해야 하며, 2개의 대표적인 SEC MEK 3개의 균주가 겔에 나타나 있다 85 2 0 8 2 및 변형의 더 적은 유형 3 A. JCSC 2 90 SSC MEC 3은 257 염기쌍의 유형 3 특이적 표적 및 메카 대조군 표적을 포함하여 2개의 PCR 산물의 존재를 기반으로 식별됩니다.

지배적인 SEC MEC 3은 또한 280 염기쌍에서 수은 목표에 대해 양성이며, 이는 인접한 SEC 원소에 전달되어 덜 일반적인 SEC MEC 3 A five와 구별되는 역할을 합니다. 대표적인 SEC MEC 4개 원소는 유형 4 A, 4 B, 4 C, 4 D, 4 E, 및 4 F를 포함하여 도시되어 있습니다.SC MEK 1 내지 3과 달리, MECK A를 제외한 SCC MEK 4 하위 유형 모두에 존재하는 단일 타겟은 없습니다. 대표적인 SCC MEK 4 E 균주는 CCR AB 4 생성물뿐만 아니라 유형 4 E 밴드의 존재에 기초하여 식별되며, 인접하는 부속 요소 및 유형 4 C 생성물에 존재하는 것으로, SEC MEK 4 E가 SE Cmk 4 CSCC MEK 4 F와 동일한 J 1 영역을 공유하기 때문에 존재하는 4 C 생성물은 동일한 J 3 영역을 공유한다는 점에서 SEC MEK 4 E와 유사하며, 결과적으로 4 E 타겟에 대해 양수일 뿐만 아니라 CCR AB 4 타겟에 대해서도 양수입니다. 인접한 액세서리 요소. 그러나 S, CMK 4F는 타입 4 C 타겟이 없다는 점에서 S, CMK 4, E와 구별될 수 있다.

일반적인 SE CMK 5는 다음과 같습니다. 겔에 존재하는 두 개의 PCR 산물, 325 염기쌍의 5형 특이적 밴드와 147 염기쌍의 ME a 대조군. 마지막으로, 이 분석의 목적은 SEC MEK에 대한 명확한 식별을 제공하는 것이 아니었지만, 특정 PCR 패턴이 이러한 유형의 존재에 대한 암시적인 증거를 제공하기 때문에 두 가지 모두에 대해 6개 또는 8개의 대표 균주가 포함되었습니다.

Meck A 타겟 외에도 대표적인 SEC MEK six는 주요 CCR 복합체 유형인 106 염기쌍에서 양의 CR AB 4 제품을 생산할 것으로 예상됩니다. 대표적인 SEC MEC 8은 또한 147 염기쌍에서 MEC A에 대해 양성이고, 106 염기쌍에서 C-C-R-A-B 4에 대해 양성이며, 동일한 J 2 영역, SEC MEK 2를 갖는 결과인 양성 유형 2 특정 생성물을 기반으로 SEC MEK 6과 구별됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 분석의 정교한 특성과 반응에 존재하는 많은 수의 프라이머로 인해 어려움이 있을 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다.

이를 개별 실험실에 적용하는 동시에 DNA 템플릿 준비 및 PCR 시약 브랜드와 같은 특정 주요 문제에 세심한 주의를 기울이면 이 목표를 크게 달성할 수 있습니다.