Name: での採餌行動のためのシングル·フライアッセイショウジョウバエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T21:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: 学ぶシングルフライアッセイによるDrosophila melanogasterの採餌行動解析。飢餓状態の変化を定量化し、嗅覚依存性の食物探索行動と神経回路機能の関係を明らかにする手法です。

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この作品は、国立衛生研究所（R01DK092640）、国立科学財団（0920668）からJWWに研究助成金によって支えられている。

1。ハエ収集と飢餓<ol><li> 12時間の明/暗サイクルで制御された温度および湿度条件下で、実験後方ハエ（ 例えば、21°C、相対湿度50〜60％）。 </li><li>女性は羽化の日に飛ぶ収集し（最大30バイアル当たり）新しい食品バイアルに、4〜5人の男性と一緒に、それらを配置する。年齢は2〜5日飛ぶ。 </li><li>フライ飢餓のための室を準備します。 <ol><li>空のプラスチックバイアルの底に、単一の組織（4.8×8.4インチ）を押します。完全に蒸留水を用いて組織を浸す。組織を押し下げ、ゆっくりと余分な水分を絞り出すようにオブジェクトを使用します。 </li><li>余分な水を廃棄するように、バイアルを反転します。湿った、しかし、ハエを紛らすのに十分ではないで水和ハエや飢餓室を維持するのに十分な水があるはずです。 </li></ol></li><li>飢餓室に食品のバイアルからハエを転送し、実験を開始する前に、バイアルを約18〜24時間後に接続します。保存する一晩、制御された温度と湿度の条件の下でバイアル実験は次の日に開始されるまで。 </li></ol> 2。食品臭気の調製<ol><li>アガロースガラスフラスコ内の10mlの蒸留水に低い溶融温度を0.1gを添加して1％アガロース溶液を調製する。それが沸騰し始めるちょうどまで電子レンジでアガロース溶液を加熱しますが、それは上に沸騰するかなり前。 <ol><li>電子レンジを止めて、一度、フラスコを旋回。アガロースが完全に溶解するまでさらに2回、この手順を繰り返します。 50℃に設定したホットプレート上で、フラスコを暖かく保つことにより液体状態でアガロース溶液を保つ</li></ol></li><li> 1％のリンゴ酢液を作るために1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに1％アガロース溶液を990μLとリンゴ酢の10μlを加える。ボルテックス混合するまで溶液を50℃に設定し、ドライ風呂インキュベーター内の場所</li></ol> 3。テストルームと行動室のセットアップ<ol><li&gt;希望条件（ 例えば 、温度、湿度）に試験室を設定します。 </li><li> LEDパネル（660 nm）をオンにします。 </li><li>お湯で篩および試験プレートをすすぎ、水分が全て蒸発するまで乾燥オーブンでそれらを加熱する。実験を開始する前に、試験室温にモレキュラーシーブ、プレートを冷却する。 </li><li>拡散板の上に浅い皿を置き、現地の湿度を高めるために、アガロース液滴の水をマスクするために水でそれを埋める。 </li><li>水皿の上でモレキュラーシーブを配置します。 </li></ol> 4。テストプレートにロードして飛ぶテスト版の仕様との図は、補足ファイル]セクションにあります。テストプレートは、透明なアクリル製で、6テストアリーナで構成されている。シンプルなスライダーがで、それぞれの室にハエのロード、一時的な封じ込め、および6ハエの同時放出を可能に保持チャンバーが含まれています実験開始。プレート中の各競技場の中央でエッチング十字線は、匂い物質をピペットでされるべき場所を示す。 <ol><li>アクリルテストプレートにスライダーを挿入します。 </li><li>優しく綿栓過去バイアルに吸引器をスライドさせて約6ハエがaspirator.itに歩くことを許可することは、それらを取り扱う際にはできるだけ優しくすることが重要です。一つは、薄暗い光源に向けて、バイアルの開口部を指すことによって吸引器に向かってクロールするハエを誘導することが走光性フライの動作を利用することができる。必要であれば、人はまた、約6メスのハエを吸引する穏やかな吸引を適用してもよい。 </li><li>テストプレートの第1穴に吸引器の先端を挿入します。シングルフライ、保持セル内に通過させ、ゆっくりと次のホールにフライをロードするために前進スライダを進めることができます。ハエは、プレートの全6保持セルを占有するまで継続する。 </li><li> CRの中心に直接1％リンゴ酢アガロース溶液をピペット5μLテスト板の内側面におけるOSS-毛。 </li></ol> 5。テストプレートを配置<ol><li>テストプレートを中央に、「位置決めTool.vi.」という名前のファイルを開きます位置決めツールの「LabVIEWのVI。 viは補足ファイル]セクションにあります。画面の左上隅にある白い矢印をクリックして、ファイルを実行します。 </li><li>アリーナの開口部がふるい床に面しており、臭気ターゲットはプレートの天井になるように、ふるいの上にテストプレートを置きます。モニター画面上の十字線を使用したテストプレートの背面にエッチングされた十字線の位置を合わせます。 </li><li>アライメントが完了すると、ディスプレイの左上隅に位置する赤い点をクリックすることで実行を中断する。 </li></ol> 6。実験中にフライ位置を記録<ol><li>各食品の検索試験中にハエの座標を追跡し、記録するために、収集ソフトウェアファイルを開き「FLYトラッキング - シックスZones.vi「LabVIEWのVIは「フライ追跡 - シックスZones.viは「補足ファイルのセクションを参照してモニターの左上隅にある白い矢印をクリックして、ファイルを実行します。 。 </li><li>ファイルに名前を割り当てて、上で「OK」をクリックします。 </li><li>テストアリーナにハエを解放するために、試験室でスライダを進める。これは解析ソフト座標との不適切なアライメントにつながるように、試験室を移動させないように注意してください。 </li><li> &quot;スタート&quot;（録音が始まる）をクリックして、検査室での光の唯一の供給源は、660nmのLEDパネルであることを確認してください。 </li><li>試験が終了すると、ふるいや行動チャンバーを取り外します。ふるいからテストプレートを持ち上げ、氷の中にプレートを浸漬することでハエを削除します。そっとお湯でプレートをきれいにし、任意のアガロース片を除去。水分を除去するために乾燥炉での試験プレートを配置します。 </li><li> Smalのをオンにすることで、テスト場所を換気約2分間のLファン。ファンの電源をオフにして、次のテストプレートにハエの次のグループをロードします。 </li></ol> 7。カスタムソフトウェアを使用したデータ分析 「フライトラッキング6つのゾーンを持つデータ分析「補足ファイル]セクションにあります。データ取得中に、取得ソフトウェア·レコードの個々のハエ位置は、テキストフ​​ァイル内の各時点の座標。試験プレートの上方に配置された単一のデジタルカメラは、0.5ヘルツのフレームレートで画像を取得する。 「フライ·トラッキング·6つのゾーンをデータ解析」は、そのテキストフ​​ァイルから情報を抽出し分析ソフトウェアプログラム）が平均速度を計算し、b）正常臭気源を配置し、フライc）は、グラフィカルウィンドウを構築する時点を決定するそれは見ることができるように、場所、時間をかけて、時間と平均フライオーバースピード臭気源からのハエの距離を飛ぶ。また、SPREに簡単にエクスポート用のデータをフォーマットadsheetプログラム。このマクロでは、食品検索遅延はアリーナの中央の半径5mm以内に少なくとも5秒を費やすハエた時点として定義される。 <ol><li> &quot; - 6つのゾーンフライ追跡のためのデータ解析「解析ソフトウェアファイルを開きます。の「Windows」タブで、「新しいテーブルを作成します。」をクリックしてください6テーブルが作成されるまで、この手順を繰り返します。 </li><li> 「マクロ」タブで、をクリックして「Foodfinding。 &quot;メインパネルには、以下のオプションを使用して表示されます：オープン生データは、レイアウト用のファイル、オープンRAWデータは、データ·ファイルのファイル、フライ場所、距離、スピード、レイアウト、FormatDataFile。 </li><li> 、テキストフ​​ァイルに値を追加することなく、生のデータを表示するにはをクリックして「レイアウトのためのオープンRAWデータファイル。 &quot;表示されるブラウザウィンドウでの実験データファイルを探し、選択します。をクリックして「開く」 </li><li> 6アリーナ（各フライを描いた6 XYプロット」のそれぞれで各ハエの場所を表示するには、 &quot;フライの場所」をクリックします時間をかけてs位置）は画面に表示されるはずです。 </li><li> （時間の経過に臭気源からハエの距離を描いた6プロットが画面に表示されます）臭気源からの各ハエの距離を表示するには、「距離」をクリックします。 yは5ミリメートルでの水平線は、フライ食品源に位置していると考えられるしきい値を示す。 </li><li> （時間をかけてハエのスピードを描いた6プロットが画面に表示されます）試験期間中に、各ハエの平均速度を表示するには、「スピード」をクリックします。 </li><li> （最初の50秒の間）の平均速度に加えて、各ハエ（図1）のための臭気源を見つけるの待ち時間、すべてのハエの位置、距離、速度グラフでレイアウトを表示するには、「レイアウト」をクリックします。適切にレイアウトを表示するためには、マージンを調整する必要があり得る。これを行うには、最初のレイアウトウィンドウをクリックしてください。 「ファイル」タブで、「レイアウトのページ設定。」をクリックしてくださいに余白をリセット0.2インチとで「OK」をクリックします。すぐにそれぞれの場所プロットの左の見出し「速度」とした小さなテーブルで「レイテンシ」各見出しの下に入力した値は、秒単位の平均速度100mm /秒と食品の検索の待ち時間を示す。レイテンシの下の空白のエントリは、ハエが臭気発生源を突き止めることができなかったを示している。食品検索遅延はハエは、チャンバの中心から半径5mm以内に少なくとも5秒を過ごした時点として定義される。 </li><li>レイアウトを印刷するには、レイアウト領域（現在のファイルへの更新·レイアウト）をクリックしてください。 「ファイル」をクリックし、をクリックして「印刷レイアウト。 &quot; </li><li>次のファイルを表示するには、単にクリックして「レイアウトのためのオープンRAWデータファイル。 &quot;あなたが上で表示し、クリックしたい次の生データファイルをクリックして「OK」新しいデータファイルを使用してウィンドウを更新するために、レイアウトウィンドウをクリックします。 </li><li>設定は、後で使用するために、実験ファイルに保存することができる。 </li></ol> 8。からのデータのエクスポート表計算プログラムへのデータ解析ソフトウェア<ol><li>それぞれのファイルに対して、速度とレイテンシのデータをエクスポートするには、をクリックして「開く生データがデータ·ファイルのファイル。 &quot;実験データファイルを選択し、をクリックして「開く。」新しいブラウザウィンドウが表示されます。 </li><li>新しいブラウザウィンドウで、「新規作成」を右クリックしてをクリックして「テキストドキュメント。 &quot;新しいテキストドキュメントに名前を付けます。新しい名前のテキストフ​​ァイルを選択し、をクリックして「開く。」これはテキストフ​​ァイルに生データファイルからのデータを格納します。 </li><li>別のファイルからデータをエクスポートするには、「オープン生データがデータ·ファイルのファイル。」をクリックしてください別のファイルをクリックし、をクリックして「開く。」 ）ステップ8.2からテキストフ​​ァイルを選択します。エクスポートする残りのデータファイルに対してこの処理を続行します。 </li><li>すべての必要なデータファイルがテキストフ​​ァイルに追加されたら、をクリックして「形式のデータファイル。 &quot;ドキュメントは、前のステップからのデータを保存し、「開く」をクリックするために使用されるテキスト（新しいWINDOを選択wは自動的に）開きます。 </li><li>ウィンドウ内に新しいテキストフ​​ァイルを作成し、ファイル名を割り当てて、をクリックして「保存」。これは、各フライのテキストフ​​ァイル名を含むファイル、平均速度、および待ち時間を作成し、表計算プログラムにインポートすることができます。 </li><li>累積的なプロットは、時間の関数（図3）などの食品臭ターゲットに到達するハエの総数のデータから構築される。 </li><li>実験データセットは、比率のZ検定を用いて統計的有意性について分析する。 </li></ol>

<ol><li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDethier%2C+VG+%22The+hungry+fly+%3A+a+physiological+study+of+the+behavior+associated+with+feeding%22">The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding</a>. , Harvard University Press. (1976).</li>
<li>Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+facilitation+by+neuropeptide+signaling+mediates+odor-driven+food+search%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search.</a> Cell. 145, 133-144 (2011).</li>
<li>Root, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+presynaptic+gain+control+mechanism+fine-tunes+olfactory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior.</a> Neuron. 59, 311-321 (2008).</li>
<li>Semmelhack, J. L., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Select+Drosophila+glomeruli+mediate+innate+olfactory+attraction+and+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion.</a> Nature. 459, 218-223 (2009).</li>
<li>Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+responses+of+Drosophila+to+biogenic+levels+of+carbon+dioxide+depend+on+life-stage%2C+sex+and+olfactory+context%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context.</a> J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).</li>
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<li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li>
<li>Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+modification+of+behavior+in+Drosophila+by+targeted+expression+of+a+temperature-sensitive+shibire+allele+in+defined+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons.</a> J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).</li>
<li>Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+expression+of+tetanus+toxin+light+chain+in+Drosophila+specifically+eliminates+synaptic+transmission+and+causes+behavioral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects.</a> Neuron. 14, 341-351 (1995).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
</ol>

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

このプロトコルでは、食品の検索行動の分析のためのステップバイステップの手順を説明します。食品関連臭気に加えて、それはまた、他の臭気のオブジェクトを検索するハエの能力の研究のために適合させることができる。例えば、それは男性のハエ3におけるメイトローカリゼーション行動の研究に向かって適用してもよい、いくつかの追加の考慮事項は、我々は、この手順についてここで言及します。このプロトコルのためにあります。： まず、飼育温度が実験ハエが試験前に熟成させなければならない期間が決まります。それは、年齢の範囲は、実験のために最も適切な年齢を決定するために検査することをお勧めします。 21℃で飼育するとき、彼らは4〜5日齢された後に、たとえば、我々の経験では、給餌や飢えフライ応答の間の違いは、最も堅牢である。 第二に、LEDは、目の下に一定作成するのに役立つ、ガラス拡散板、均一な照明を照らす電子アクリルチャンバ。も十分、定数、明るい照明がハエの動きを自動的に追跡するために重要である。不均一な照明や光源をちらつきがハエの位置を...

食品の検索と食料消費1：飢餓の状態は欲求行動の2種類を推進しています。この単純な行動アッセイは、2,3採餌に関連する走化性行動の研究のために有用である。具体的には、食品の匂いターゲットを見つけるに飛ぶ位置、歩行速度と遅延を追跡します。食品所見のレイテンシは、その内部欲求状態の変化の下流フライ臭気検出システムの感度の変化を測定するための測定基準として機能する。このアッセイの説明書のバージョンは、以前はGABA-B受容体シグナル伝達が3ハエ成虫における臭気定位挙動にとって重要であることを示すために使用した。アッセイの現在の自動化されたバージョンはどのように短い神経ペプチド-F（sNPF）のシグナル伝達の研究に尽力したショウジョウバエの嗅覚マップの形状を変更し、影響が行動2を食欲。 試験は暗い、温度及び湿度制御された部屋で行われる。デジタル透明アクリルのテストプレートの上に設定されたビデオカメラは、660 nmのLED照明によりバックライトハエを追跡。カメラからの情報は、次の検査エリアに駐留するコンピュータによりリアルタイムで処理される。我々は、試験期間中にフライ位置の座標を記録して保存するデータ取得ソフトウェアを使用する。 このパラダイムでは、被写体が中央に食べ物の匂いが含まれているアリーナ中に放出され、臭気オブジェクトは、フライ食品の検索動作を誘導アリーナ内の食品のにおいのグラデーションを作成します。同じような匂い検索プロトコルは、単一のショウジョウバエの幼虫7における化学感覚の研究に向かって適用されている。このような4フィールドオルファクトメーター4,5またはT-迷路6など他の行動アッセイは、臭気嫌悪やアトラクションの行動を評価しながら、このパラダイムは、嗅覚感度および走化性行動を評価することが最も適しています。 いくつかの重要な利点は、このASSAに同行Y。データ収集と分析は主に自動化されているので、第一に、それは、大規模なデータセットの迅速な取得を可能にする。第二に、このアッセイは、単離するので、それらの挙動に影響を与え得る社会的嗅覚の手がかりを排除する、単一のハエの行動を測定する。第三に、プロトコルとシンプルな実験デザインのシンプルさは、アッセイが、効率的で他の人を教えることが簡単になります。 さらに、このアッセイは、さらに、 キイロショウジョウバエ 8で使用可能な大規模な遺伝的ツールキットと組み合わせることにより、食物探索行動の基礎となる神経回路をプローブするために使用することができる。無音またはするニューロンを興奮させることを目標と導入遺伝子の発現は、GAL4-UASシステムだけでなく、UAS-shibireのTS1、UAS-破傷風毒素、およびUAS-TRPA1（B）の導入遺伝子9月12日などのツールを用いて達成することができる。

<table><tbody><tr><td>アップルサイダービネガー</td><td>スペクトラム</td><td></td><td>市販の</td></tr><tr><td>アガロース、タイプVII</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A0701</td><td>低ゲル化温度アガロー</td></tr>ス<tr><td>アクリルテストプレート</td><td></td><td>カスタム</td><td>プレートには6つのアリーナが含まれています。各アリーナの直径は60mm、高さは6mmです。特定の測定については、テストプレート図を参照してください。</td></tr><tr><td>LabVIEW V.8.5</td><td>National Instruments</td><td>776670-09</td><td>プログラム用プラットフォーム:PositioningTool.vi、FlyTracking--Six Zones.vi 注:「経過 time.vi」、「file.vi への時間」、「2つのオブジェクト detect.vi」は、メインのデータ収集プログラム「FlyTracking--Six zones.vi」を実行するために利用可能でなければならないサブルーチンが含まれています。</td></tr><tr><td>LabVIEW Vision 8.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Vision入力ソフトウェア 8.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Vision Builder AI 3.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro V.6</td><td>Wavemetric, Inc.</td><td></td><td>マクロ用プラットフォーム:フライトラッキング用データ分析--シックスゾーン</td></tr><tr><td>Basler scA1390-17fm</td><td>National Instruments</td><td>779980-01</td><td>デジタルカメラ 注:カメラ用ドライバー Baslerweb.com</td></tr><tr><td>8mmレンズ</td><td>National Instruments</td><td>780024-01</td><td>Baslerデジタルカメラ用レンズ</td></tr><tr><td>すりガラス ディフューザープレート</td><td>Edmund Optics</td><td>custom</td><td>拡散光、25 cm x 30 cm</td></tr><tr><td>USNo. 100</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>04-881X</td><td>ふるい (公称開口数 150 &mu;m</td></tr><tr><td colspan="4">照明オプション 1</td></tr><tr><td>LED バックライト 660 nm (20 cm x 20 cm)</td><td>Spectra West</td><td>BL47192</td><td>、よりシンプルですが、より高価な照明オプションです。</td></tr><tr><td>LEDバックライト</td><td>用電源 Spectra West</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Lighting Option 2</strong</td></tr><tr><td>>660 nm LEDs</td><td>Superbrightleds</td><td>RL5R1330</td><td>Wavelength 660 nm (14.7インチ x 9.75インチパネル用約7 x 7 LEDアレイ)</td></tr><tr><td>リニアDC電源</td><td>GW Instek</td><td>GPS-1830D</td><td>LEDパネル用電源</td></tr><tr><td>無はんだブレッドボード</td><td>Digikey</td><td>922354-ND</td><td>LED用ブレッドボード</td></tr></tbody></table>

での採餌行動のためのシングル·フライアッセイショウジョウバエ

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

多くの動物の場合は、飢餓は、適切な食料源の検索を容易にする方法で、嗅覚系の変化を促進する。このビデオの記事では、我々は大人のフルーツキイロショウジョウバエを飛んでの嗅覚に依存する食品の検索行動に空腹や満腹の効果を測定するための自動化されたアッセイを説明します。ショウジョウバエには見えない赤い光で照明光を通さない箱では、カスタムデータ収集ソフトウェアにリンクされたカメラは、同時に6ハエの位置を監視します。各ハエを中心に食品の匂いを含む個々の競技場の中を歩くに限定されている。臭いの蓄積を防ぐために機能し、多孔性床に残りアレナステスト。臭気源、異なる生理学的状態の下で嗅覚感度を反映したメトリックを検索するレイテンシは、ソフトウェア分析により決定される。ここでは、この行動パラダイムを実行する重要な仕組みを議論し、フライLOADIに関する具体的な問題をカバーngの、臭気汚染、アッセイ温度、データ品質、および統計分析。

データ解析ソフトウェア及びレイアウトは、 図1に見られるその一例は、分析基準のセットに従って、その10分間の試験中に、各ハエの性能を評価するために使用される。以下の基準は、各ハエからのデータがデータ分析のために使用され、負傷、疾病、ストレス、または意欲の欠如のために、食品検索タスクが実行できないそれらのハエを排除するように設計されているかどうかを決定するために使用される。 300以上の秒アクティブではハエが「非アクティブ」であると考えられ、これらはA）がすでに食料源を見つけることに成功しているか、b）少なくとも100秒の平均速度&gt; 10ミリメートル/秒を発揮しない限り、データセットから拒否されます非アクティブ期間（図2a、図2b、図2c）は、以下の。 健康的なハエは、その保持室から解放されると、すぐに強力な検索行動を示す。このように、そののみハエを選択するには唯一の試験の最初の50秒間の速度の一定の範囲内でその動きを飛ぶ、アクティブな臭気検索の初期段階...

このビデオの記事では、我々は大人のフルーツキイロショウジョウバエを飛んでの嗅覚に依存する食品の検索行動に空腹や満腹の効果を測定するための自動化されたアッセイを説明します。

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

この手順の全体的な目標は、成虫のハエSalala Melanogasterの食物欠乏によって引き起こされる行動変化を定量化することです。これは、最初に飢えたハエを18〜24時間放置することで達成されます。2番目のステップは、個々のハエを行動チャンバーにロードすることであり、各ハエにはその中心に魅力的な臭気源が含まれています。次に、デジタルカメラを搭載したコンピューターシステムが、各フライの位置を経時的に追跡し、記録します。後のデータ分析のための座標。最後のステップは、カスタムソフトウェアを使用して、各フライが臭気源に到達するまでの遅延を決定することです。最終的には、このハイスループット食品探索行動アッセイを使用して、神経回路機能と行動応答との関係を研究することができます。このアッセイが既存の方法よりも優れている点は、チームメイトと同様に、単一のフライの走化性挙動を定量化できることです。この方法は、走化性行動にとってどの神経回路が重要であるか、これらの神経回路が動物の内部生理学的状態によってどのように緩和されるかなど、神経生物学の質問に答えるのに役立ちます。このメソッドの目標は、大規模な行動データセットを短時間で取得することです。この手法は、採餌行動に関する洞察を与えてくれましたが、ローカリゼーションなどの他の行動の研究にも使用できます。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。適切なフライハンドリングとコンピュータソフトウェアの実行は、この実験の成功に不可欠です。一般的に、この方法に不慣れな個々の人は、手順が針の周りになるハエを優しく示す方法を学ぶのにある程度の時間と忍耐が必要なため、最初は少し苦労するかもしれません。フライコレクションの前に私の研究室の技術者に連絡してください。実験用フライを、制御された温度と湿度の条件下で、12時間の明暗サイクルで飼育します。EECの爆発の日には、ハエを二酸化炭素下で麻酔してから、顕微鏡で性別を判定します。男性と女性を区別するために、いくつかの基本的な基準を使用できます。男性は、女性にはないセックスコームと呼ばれる4本の足に黒い剛毛のパッチを持っています。また、オスの腹部の先端は暗いキューティクルで覆われており、メスには見られない性器が露出しており、メスのハエを集めて4〜5匹の白い目のオスと一緒に新しいフードファイルに入れ、バイアルの年齢ごとに最大30匹のハエを入れます。2〜5日間のハエは、最初に空のプラスチックバイアルの底に単一の組織を押し下げ、蒸留水で組織を完全に浸すことにより、ハエの飢餓のためにチャンバーを準備します。次に、物を使ってティッシュを押し下げ、余分な水分をやさしく絞り出します。バイアルをひっくり返して、余分な水を捨てます。ハエの水分を補給し、飢餓室を湿らせておくのに十分な水が必要ですが、ハエを溺れさせるほどではありません。実験開始の約18〜24時間前に、ハエを食物バイアルから飢餓チャンバーに移し、バイアルを塞ぎます。バイアルは、実験が始まるまで、制御された温度と湿度の条件下で一晩保管してください。10ミリリットルの蒸留水に100ミリグラムの低融点アロスを加えて、1%アグロ溶液を調製します。ガラスフラスコに。アグロ溶液を電子レンジで沸騰し始めるまで加熱しますが、沸騰する前に電子レンジを止めてフラスコを一度回します。アロスが完全に溶解するまで、この手順をさらに2回繰り返します。ホットプレート上でフラスコを保温することにより、Aros溶液を液体状態に維持します。.摂氏50度に設定し、990マイクロリットルの1%aro溶液と10マイクロリットルのアップルサイダービネガーを1.5ミリリットルのアプエンドDFチューブに加えます。1%アップルサイダービネガー溶液を作るには、50°Cに設定されたドライバスインキュベーターに入れる前に、混合されるまで溶液を渦巻き、試験室を温度や湿度などの所望の条件に設定します。660ナノメートルのLEDパネルをオンにします。ふるいと試験プレートをお湯ですすぎ、乾燥オーブンで水分が蒸発するまで加熱します。涼しい。ふるいとプレートは試験室の温度まで下げられます。実験を始める前に、ディフューザープレートの上に浅い皿を置き、水で満たして局所的な湿度を上げ、アロス液滴の水を隠すようにします。最後に、ふるいを水皿の上に置きます。テストプレートは透明なアクリルでできており、6つのテストアリーナで構成されています。スライダーには、フライの装填、一時的な封じ込め、および6匹のフライをそれぞれのチャンバーに同時に放出できる保持チャンバーが含まれています。実験の開始時には、プレートの各アリーナの中央に刻まれた十字線は、臭気物質をピペットで移動する必要があることを示しています。スライダーをアクリルテストプレートに挿入します。吸引器を綿栓を過ぎてバイアルにそっと滑り込ませ、約6匹のハエが吸引器に入るのを待ちます。それらを取り扱う際には、できるだけ穏やかにすることが重要です。写真戦術、ハエを誘発するハエの行動、薄暗い光源にバイアルの開口部を向けることによって吸引器に向かって歩くことを利用することができます。必要に応じて、穏やかな吸引を適用して、約6匹の雌のハエを吸引することができます。白目のオスのハエは避けてください。アスピレーターの先端をテストプレートの最初の穴に挿入します。1 つのフライが保持セルに入るのを待ち、スライダーをゆっくりと前方に進めて、別のフライを次の穴にロードします。飛ぶまで続けます。プレートの6つの保持セルすべてを占めます。次に、1%アップルサイダービネガーのアガロ溶液の5マイクロリットルを、テストプレートの内側面の十字線の中心に直接ピペットで移します。テストプレートを中央に配置するには、Positioning tool viという名前のファイルを開きます。画面の左上隅にある白い矢印をクリックして、ファイルを実行します。アリーナの開口部がSIVの床に面し、臭気ターゲットがプレートの天井にくるように、テストプレートをSIBの上に置きます。位置合わせが完了したら、テストプレートの十字線をモニター画面の十字線に合わせます。モニターの左上隅にある赤い点をクリックして実行を中止し、フライの座標を追跡して記録します。各食品検索の試用中に、取得ソフトウェアファイルを開きます。フライトラッキング6 vi.モニターの左上隅にある白い矢印をクリックして、ファイルを実行します。ファイルに名前を付け、[OK] をクリックします。試験チャンバーのスライダーを前進させて、ハエを試験アリーナに放出します。試験室を動かさないと、座標の不適切な記録につながるので注意してください。[スタート]をクリックし、試験チャンバー内の唯一の光源がLEDパネルであることを確認します。試験が終了したら、ふるいとビヘイビアチャンバーを取り外します。試験プレートをふるいから持ち上げ、プレートを氷に沈めてハエを取り除きます。プレートをお湯でやさしく洗浄し、アグロスの破片を取り除きます。テストプレートを乾燥オーブンに入れて水分を取り除きます。小さなファンを約2分間回して、テストエリアを換気します。ファンをオフにして、次のハエのグループを次のテストプレートにロードします。テキストプロトコルで説明されているように、カスタムソフトウェアを使用してデータ分析を実行します。データ分析ソフトウェアとレイアウトは、一連の分析基準に従って、10分間の試行中の各フライのパフォーマンスを評価するために使用されます。これらの基準は、各ハエからのデータがデータ分析に使用されるかどうかを決定するために使用され、怪我、病気、ストレス、またはモチベーションの欠如のために食物検索タスクを実行できないハエを排除するように設計されています。300秒以上活動していないハエは不活性と見なされ、すでに食料源または展示物を見つけることに成功していない限り、データセットから拒否されます。非アクティブ期間後少なくとも100秒間、平均速度が毎秒10ミリメートルを超えると、アクティブ臭の初期段階で健康的な速度を示すハエのみが選択されます。データ解析では、試験の最初の50秒間に一定の速度範囲内で移動するハエのみが、アリーナ内の4つの象限すべてを通過しず、試験開始後に食料源に直行するハエが拒否されます。半径10ミリメートル以内で最低50秒間、食料源に向かって、または食物源から離れて縫うハエは、食料源を見つけることに成功したと見なされます。ハエと臭気源からの距離を経時的に描いたプロットは、ハエの位置に目に見えるアーティファクトがあるこのまれなケースのアリーナを評価するために使用できます。トレースも拒否されます。アーティファクトは、データ収集ソフトウェアがハエ以外の物体を検出した任意のイベントによって作成できます。それらはしばしば、アリーナを横切るか、その中心から放射状に広がる長い直線として表示されます。18時間から24時間飢餓状態にある成虫のハエは、餌を与えられたハエよりも食物関連の匂いに対する嗅覚感度が高くなります。食の臭いの原因をうまく特定したハエの累積割合をグラフでプロットすると、飢餓状態になったハエ全体の30%が10分以内に成功していることがわかります。対照的に、餌を与えられたハエ全体の7%だけがそうしています。飢餓状態のハエは、アグロスビヒクル単独よりも酢に有意に大きな引力を示すはずであり、この観察結果はテスト条件のトラブルシューティングに使用できます。例えば、野生型のハエを用いて摂氏32度、環境湿度35%で行われたこの餌探索実験では、酢へのハエの誘引力とアロス制御との間に有意差は検出されなかったが、これは、より暖かい試験温度下でアグロス液滴に含まれる水への引力が増加したためと考えられます。試験湿度を50〜60%に上げることにより、この行動の変化が修正され、酢への引力とアグロスビヒクルとの有意差が回復しました。一度習得すると、このテクニックは、適切に実行されれば10分間の実験的試行を含め、12で実行できます。この手順を試みるときは、ハエを傷つけたり邪魔したりしないように、ハエを非常に優しく扱うことを忘れないでください。乾燥オーブン内では試験プレートとふるいが非常に高温になる可能性があるため、開発後はオーブンミットを着用しながら取り外す必要があることに注意してください。この技術は、神経生物学の研究者が走化性行動を探求する道を開きました。この手法は、ハエが他の匂いの物体を見つける能力を研究するためにも適応させることができます。例えば、オスのハエにおける配偶者局在行動の研究に適用することができます。このビデオを見た後、実験の準備方法、実験条件の調整方法、実験の実行方法、各ハエの性能分析方法を十分に理解しているはずです。これにより、最終的には、臭気源をうまく特定したハエの割合を示す累積プロットが得られます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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