דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם במבחנה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג במהירות עמילואיד fis מכל חלבון במבחנה. זה מושג על ידי המסת החלבון הנבחר במאגר MES כדי לגרום לקיפול שגוי של המבנה. לאחר מכן ניתן לדגור את החלבון בטמפרטורה גבוהה, מה שמקדם היווצרות עמילואיד בהיעדר גורמים משלימים אחרים.

לחלופין, החלבון מקושר על ידי EDC על מנת ליצור רצועות חלבון מסיסות מיוצבות, קודמן העמילואיד. לבסוף, גורמים משלימים שאינם חלבונים מעורבבים עם אוליגומרים של חלבון מסיס מיוצב כדי לאפשר היווצרות של עמילואיד היברידי מתקבלות תוצאות המראות כי ניתן להמיר חלבונים מקומיים בקלות לאישור עמילואיד כאשר הם מקלים על ידי תנאים נוחים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחלות קיפול שגוי של חלבונים, כגון כיצד בדיוק נוצר עמילואיד מאוליגומרים של חלבונים מסיסים, והאם לסוגים שונים של עמילואיד יש פונקציות ביולוגיות ופתולוגיות מובהקות.

כדי להתחיל, הכן מאגר MES כמתואר בפרוטוקול הטקסט הן עבור חלבון עמילואיד בלבד והן עבור חלבון מסיס מיוצב. לאחר מכן כל הרצועות שוקלות את החלבון הנבחר ומרכיבות אותו מחדש ל-10 מיליגרם למיליליטר במאגר MES. בהדגמה זו משתמשים באלבומין בסרום אנושי או HSA, דגירה על התמיסה ב-65 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך ארבע שעות.

בסוף התקופה נראה משקע לבן בתמיסה. נטרל את הדגימה עם 10% נפח לנפח. T tris, HCL מבצעת דיאליזה של החלבון בקלטת דיאליזה למשך הלילה כדי להחליף למאגר הרצוי.

לניתוח נוסף, הכינו דגימת בקרה של חלבון מקומי על ידי ביצוע השלבים הבאים ללא משקעי חום. להכנת חלבון מסיס מיוצב, כל הרצועות שוקלות את החלבון הנבחר ומרכיבות אותו מחדש ל-10 מיליגרם למיליליטר. במאגר MES, השאירו את תמיסת החלבון בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

הכן מלאי טרי של 20 מיליגרם למיליליטר EDC במאגר MES. מערבבים את תמיסות החלבון וה-EDC ביחס של שתיים עד חמש, ואז מדגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לאחר הדגירה. נטרל את הדגימה עם 10% נפח לנפח של tris HCL דיאליזה של החלבון בקלטת דיאליזה למשך הלילה להחלפה למאגר הרצוי.

לניתוח נוסף. אחסן את החלבון המסיס המיוצב כל הרצועה בארבע מעלות צלזיוס למשך עד ארבעה שבועות. תרחיף זה ישמש להכנת עמילואידים היברידיים להכנת ה-DNA המכיל עמילואיד וה-RNA המכיל עמילואיד.

מערבבים, חומצת הגרעין והחלבון המסיס המיוצב כולם רצועות ביחס של אחד לאחד. השאירו את התערובת בחום של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות במהלך תקופה זו. משקעים בלתי מסיסים נראים בתמיסה כאשר ריכוז החלבון הראשוני הוא 0.5 מיליגרם למיליליטר ומעלה.

כדי להכין את תערובת הפרין המכילה עמילואיד הפרין וחלבון מסיס מיוצב, כל הרצועות ביחס של אחד לאחד לפני הדגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. בדומה לחומצת הגרעין המכילה עמילואידים במשקעים מסיסים נראית בתמיסה. כאשר ריכוז החלבון הראשוני הוא 0.5 מיליגרם למיליליטר ומעלה, היכולת להמיר חלבונים מקומיים ישירות לעמילואיד מסתמכת על השינוי המאשר שנוצר בטמפרטורה גבוהה.

במאגר MES, משקעים בתמיסה הם אינדיקציה טובה לצבירת חלבונים והיווצרות עמילואיד אפשרית כדי לאפשר לאוליגומרים של חלבונים מסיסים להתייצב. EDC משמש לקישור צולב של החלבונים כדי למצק את האישור האוליגומרי המושרה במאגר MES. כתוצאה מכך, החלבון המיוצב allgas הם חלבונים מולטימריים הנבדלים מחלבון מקומי מונומרי או אגרגטים המושרים על ידי חום.

כאשר מופרדים על ידי חלבון מסיס מיוצב בדף SDS, כל הרצועות יכולות להיקשר בקלות לחומצות גרעין, כולל DNA ו-RNA באופן בלתי תלוי ברצף. לכן, ניתן לבצע בדיקת הסטת ג'ל כדי לדמיין את האינטראקציה הישירה בין החלבון המסיס המיוצב, כל הרצועות וה-DNA, מה שיגרום לנדידה מפגרת של DNA על ג'ל AROS. ציטוטוקסיות היא אופי ארכיטיפי של חלבון מסיס.

כל הרצועות ייצבו חלבון מסיס, כל הרצועות הושרו במינון תלוי מוות תאים הניתן לזיהוי על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. כפי שמוצג כאן, תאי RP I 8 2 2 6 רגישים ביותר לחלבון מסיס, כל המוות הנגרם על ידי רצועה הנמדד על ידי צביעת פרופידיום יודיד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין סוגים שונים של עמילואיד מכל חלבון לבחירתך במבחנה.