反向酵母双杂交系统，以确定哺乳动物核受体残留的互动与配体和/或拮抗剂

该程序的总体目标是描述酵母高通量、两种杂交测定，揭示孕 X 受体或 PXR 与小分子抑制剂酮康唑之间的相互作用。这是通过首先构建酵母两个杂交质粒来实现的，一个表达人 P XR 配体结合域，另一个表达类固醇受体。酮康唑的 COACTIVATOR one 或 SRC one 的存在破坏了液体 β 半乳糖测定所揭示的人 P XR 与 SRC one 的相互作用。

在酮康唑存在下，PXR 突变体的滤纸筛选与菌落的比色筛选一起，可以识别使受体对药物作用免疫的突变，最终通过目视检查和液体 β 半乳糖的结果实现松散表达。SASE 测定用于显示酮康唑存在下 PXR 活化的变化，这允许识别参与相互作用的原始残基。我们最初是在 Manny 博士的实验室中萌生了这种方法的想法，我是该实验室的同事。

当我们面对 PXR 上不完整的结构化数据时，生化技术不允许我们进行鉴定，尤其是对于非常浅且不易修改的相互作用大小。结构表征。基于检测 kiton 抗性 PXR 突变体的原理，我们提出了一种易于处理、可行的酸，并且可以在几天内以非常高通量的方式进行。

虽然这种方法可以在受体蛋白上提供小分子的内部结合药剂作用力，但它也可以应用于其他系统，例如任何在疾病中具有致病作用的蛋白质，特别是结构生物学方法中的局限性 弯曲残基的粗略鉴定，以更好地理解和设计小分子靶相互作用子。首先扩增人 PXR 配体结合域和全长人 SRC 1，如文本方案中所述。通过在 1%aros 凝胶上运行来检查 PCR 产物。

接下来，从 AROS 凝胶中纯化 PCR 产物。按照文本方案中的说明在两种杂交载体中消化 PCR 产物，并将消化样品置于 37 摄氏度的水浴中 1 小时。从 1% agros 凝胶中纯化消化的样品，然后连接消化和纯化的 PCR 产物和两种杂交载体，然后在 37 摄氏度下孵育过夜后转化为 DH 5 α 感受态细胞。

挑选菌落并分离血浆 DNA，使用限制性内切酶消化以确认载体和插入片段的存在，通过测序验证所有阳性血浆 DNA。将酵母菌株接种在 5 毫升 YAPD 中，并在 220 RPM 和 30 摄氏度下不断搅拌孵育过夜。第二天早上，将酵母接种 1 至 20 毫升 YAPD 中，并通过恒定植被孵育以获得 600 纳米的光密度 0.2。

在微量离心机中以 2000 RPM 的转速沉淀细胞 2 分钟，然后弃去上清液。然后用高压灭菌水洗涤沉淀两次，用 0.1 摩尔乙酸锂洗涤一次。弃去最终洗涤液的上清液后，将文本方案中列出的转化试剂添加到细胞沉淀中并涡旋混合。

然后在混合前添加准备好的含有 PXR 和含有 SRC 的载体。再次将转化混合物移液到聚苯乙烯圆底管中，搅拌 30 分钟。将试管移至 42 摄氏度的水浴中，再孵育 30 分钟。

接下来，去除上清液后，以 2000 RPM 的速度离心试管 2 分钟。用高压灭菌器水吸管清洗沉淀一次，将 100 微升无菌水移入试管中，然后用手指轻轻敲击和移液重悬细胞。然后将细胞接种到不含组氨酸和亮氨酸的 dropout 培养基上，并在 30 摄氏度下孵育 3 至 4 天以分离转化体。

要开始 Xga 滤膜测定，请从硝酸纤维素膜上切出一个三角形，以适合培养皿的 10 毫米部分。标记硝酸纤维素膜以标记方向。将预先标记的硝酸纤维素膜放在酵母菌落上，确保膜与板培养基表面接触。

取下膜。将其菌落面朝上放在 3 毫米的滤纸上，并将膜和滤纸置于零下 80 摄氏度 15 分钟。接下来，将两圈 3 毫米的滤纸放入培养皿中，并用 5 毫升 xal 溶液浸泡。

从培养皿中排出多余的缓冲液，将硝酸纤维素膜放入培养皿中，菌落面朝上。盖上盖子，确保膜与滤纸完全接触并且完全湿润。包裹 Petri 版箔纸，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，使酵母过夜生长，并滴出不含组氨酸和亮氨酸的液体培养基，光密度为 600 纳米 0.7。

将 1 mL 培养基转移到 1.5 mL 微量离心管中，并以 3000 RPM 离心 2 分钟。弃去上清液后，向沉淀中加入 1 毫升 Z 缓冲液并离心。和以前一样，加入 150 微升 Z 缓冲液和肿瘤 capto 乙醇以重悬细胞沉淀。

然后大力加入 50 微升氯仿和 20 微升 0.1% SDS。涡旋样品 15 秒。接下来，在 700 微升 ONPG 溶液中，设置计时器并在 30 摄氏度下孵育足够长的时间，以使黄色显现。

颜色显色后，记下总反应时间。加入 500 微升 1 摩尔碳酸钠以终止反应。然后测定 420 纳米处的吸光度。

作为最后一步，按照文本协议中的说明计算 Miller 单位。由于酵母具有显著的无菌生产，因此无需额外的外源配体即可诱导酵母中的松弛表达。xal 提升测定显示，蓝色菌落可视化的松弛表达在用 PXR 和 SRC one 转化的酵母菌株中被诱导。

这也显示在 β glaces 液体测定中。然而，在单独使用空载体 PXR 或单独使用 SRC 载体转化的酵母中，不会诱导松弛表达。酮康唑破坏酵母中的 P XR 和 SRC one 相互作用，因为来自复制过滤器的所有菌落都是白色的，液体酶测定的 β 半乳糖酶活性显着降低也证明了这一点。

当在 P XR 双突变体上用 S rrc one 进行酵母转化时，它揭示了暴露于酮康唑的菌落仍然保持松散的表达。这类似于该实验室先前的研究，该研究表明相同的 PXR 可以被强配体激活，但在哺乳动物测定中不受酮康唑的拮抗作用的影响。观看此视频后，您应该对如何进行仔细的杂交 AC 以及研究蛋白质上小分子弯曲残基所需的必要修饰有一个很好的了解。

尝试此程序很重要，请记住获得高度多样化的受体突变体库，实现每 200 个以上的良好转化效率，在有或没有药物的情况下就地开发几乎相同的过滤器复制品，最后进行准确的视觉和化学检查以进行 nase 检测。按照此程序，可以执行其他方法，如 Ian 200 a Acids 蛋白 pro 作为酸和 iCal 对接同源模型，以回答其他问题，例如至少弯曲适用于蛋白质人类细胞的 uc。如果是这样，可以制作模型防御，这种残基作为药物。