Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare qualitativamente e quantitativamente lo stress ossidativo in embrioni di pesce zebra viventi. Ciò si ottiene aggiungendo una soluzione ossidativa agli embrioni preparati per l'induzione dello stress ossidativo o creando un margine della ferita sulla pinna caudale dell'embrione. Gli embrioni vengono quindi processati per il rilevamento dello stress ossidativo con un metodo a singola cellula o con un metodo a montatura intera.

Successivamente, i preparati vengono incubati con una sonda di rilevamento Ross. I risultati possono mostrare la quantità di stress ossidativo e il livello di Ross in base alla microscopia confocale di supporti di fori o all'analisi citofluorometrica di singole cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immuno Fluor per i marcatori di stress ossidico è che consente la rilevazione grezza nel contesto di un organismo vivente e la quantificazione a livello di singoli tessuti.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca di base, come l'esplorazione delle condizioni di stress ossidativo nel contesto di uno stato patologico. Gli individui nuovi al momento dell'ammissione possono avere difficoltà a causa di danni accidentali ai tessuti perché le sonde molecolari sensibili grezze possono essere una fonte non pianificata di acidità. E poiché alti livelli di stress ossidativo devono provocare la morte cellulare, mentre troppo poco può essere difficile da rilevare con la pratica e la sperimentazione, questi problemi si verificheranno solo da soli Quando si prepara la soluzione per indurre lo stress ossidativo ai mitocondri composti da marciume noto nel DMSO, dovrebbe essere fatta con marciume noto a una concentrazione compresa tra cinque e 50 micromolari e mai superiore a 100 micromolari marcio noto è tossico e pericoloso.

Prestare attenzione alle precauzioni indicate. La soluzione della sonda per il rilevamento di Ross con montaggio su foro non deve essere esposta a luce o ossigeno durante la sua preparazione e deve essere preparata fresca per il metodo di rilevamento di Ross a cella singola. Una soluzione di arresto di FBS in PBS deve essere preparata e mantenuta a quattro gradi Celsius.

Altre preparazioni includono l'impostazione dell'incubatore ad aria zebrafish a 28 gradi Celsius e, per il metodo a cella singola, il raffreddamento della centrifuga a quattro gradi Celsius. Vengono eseguiti incroci di zebrafish, raccolta di embrioni e anestesia. Utilizzando la metodologia standard, raccogli gli embrioni di interesse tra le 48 e le 72 ore dopo la fecondazione.

Dopo aver anestetizzato gli embrioni, lavare via l'anestetico due volte, quindi caricare gli embrioni in tre piastre con non più di 30 per piastra per il rilevamento grezzo di una singola cellula. Raccogli almeno 35 embrioni per condizione in più piatti. Successivamente, applicare 10 millilitri di soluzione ossidante o come controllo negativo.

Applicare 10 millilitri di acqua, quindi attendere da 10 a 60 minuti mentre gli embrioni incubano a 28 gradi Celsius. Preriscaldare anche l'HBSS a 28 gradi Celsius per il lavaggio. Dopo l'incubazione, trasferire gli embrioni in un nuovo piatto di HBSS caldo e agitare.

Quindi procedere con il rilevamento di Ross a montatura intera o a cella singola. Un'opzione più fisiologica è quella di generare stress dopo un danno tissutale utilizzando la tecnica di ferita della pinna caudale descritta da NI Tomer and company. Dopo il trattamento con ossidante, trasferire gruppi di massimo 10 embrioni in piccole provette.

Sciacquateli abbondantemente con HBSS e proteggeteli dalla luce con un foglio. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di rilevazione grezza a ciascuna provetta e incubare le provette per 15 minuti a 28 gradi Celsius durante l'incubazione. Preparare un vetrino per contenere sia il controllo che la condizione sperimentale.

Coprire un vetrino a depressione con 300 microlitri di metilcellulosa. Non formare bolle durante l'espulsione della metilcellulosa. Dopo l'incubazione dell'embrione, sostituire rapidamente la soluzione nelle provette con due millilitri di HBSS e capovolgere le provette più volte per lavare gli embrioni.

Quindi aspirare gli embrioni nella punta di una micropipetta ed espellerli delicatamente nel vetrino trattato. Orientare gli embrioni utilizzando una linea sottile di nylon e procedere con l'uso di un microscopio a scansione fluorescente o confocale per l'analisi. Assicurati di analizzare tutti gli embrioni con le stesse impostazioni.

Trasferire gli embrioni dal lavaggio HBSS in un nuovo piatto, rimuovendo la maggior parte possibile della soluzione. Ora decappucciare manualmente gli embrioni. Questo è veramente necessario per dissociare gli embrioni in singole cellule.

Quindi, sposta gli embrioni in una piastra a 24 pozzetti, carica 15 embrioni in ciascuna. Riempi in modo ottimale tre pozzetti per ogni condizione. Successivamente, rimuovere tutta la soluzione e sostituirla con 300 microlitri di HBSS, 30 microlitri di collagenasi p e 50 microlitri di tripsina EDTA.

Utilizzando un puntale per pipetta da un millilitro, omogeneizzare gli embrioni con Trier. Una volta preparati tutti i pozzetti, trasferire la piastra a 28 gradi Celsius per almeno 20 minuti ogni cinque minuti, tritrare i campioni per garantire una buona omogeneizzazione. Metti anche dei micro tubi di fuga sul ghiaccio per raccogliere i fazzoletti quando sono pronti.

A 20 minuti, prelevare un campione e verificare al microscopio che il tessuto sia disgregato in una sospensione di una singola cellula. In caso contrario, continuare l'incubazione per un massimo di 30 minuti in totale. Quando il tessuto è pronto, interrompere la reazione con altri 200 microlitri di soluzione di arresto.

Mescolalo con TRI utilizzando un puntale per pipetta da un millilitro. Quindi, trasferisci il contenuto di ciascun pozzetto in un tubo micro fuge pre-raffreddato e tieni questi tubi sul ghiaccio al riparo dalla luce. Quindi centrifugare i campioni a 250 GS per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

E poi rimuovere il surnatante per aspirazione. Risospendere il pellet di cella in HBSS ghiacciato con tri delicato e verificare che la sospensione abbia almeno 2 milioni di cellule. Quindi, risospendere le cellule in un millilitro della soluzione della sonda sensibile grezza.

Incubarli a temperatura ambiente e al buio per circa tre minuti. Regolare empiricamente questo tempo di incubazione. Quindi, trasferisci le celle in tubi fax schermati dalla luce.

Procedere con le analisi via fax per rilevare il marcatore transgenico. Fluorescenza e fluorescenza della sonda di Ross Durante l'analisi. Calcola sempre i livelli di perdita all'aumentare della piega rispetto ai campioni di controllo per normalizzare la fluorescenza di fondo.

Tutti i rilevamenti di Mount Ross sono stati utilizzati per esaminare l'accumulo di perossido di idrogeno in un sito della ferita. Le code intatte e quelle ferite sono state confrontate dopo 20 minuti di trattamento con ossidante. In entrambe le condizioni è stato rilevato un segnale non specifico.

Lo stesso esperimento con il pre-trattamento degli embrioni per abbassare i livelli di perossido di idrogeno. L'uso dell'inibitore OX VA 28 70 ha rivelato che i segnali rilevati dipendevano effettivamente dal marciume da accumulo di Ross. Gli embrioni trattati noti sono stati esaminati anche per montatura intera.

Ad alto ingrandimento si potevano identificare regioni anatomiche. Ciò ha prodotto Ross, come indicato dal conteggio a fluorescenza delle cellule Ross positive via fax, è stato eseguito per il rilevamento di Ross a singola cellula. Questa analisi è stata effettuata senza l'inclusione di cellule morte. Controllo.

Sono state analizzate anche le cellule senza trattamento. Il confronto di questi risultati ha reso molto semplice la quantificazione dell'accumulo di Ross. Il test si rivela eccellente per testare qualsiasi numero di manipolazioni sperimentali.

Una volta padroneggiata questa tecnica, una tecnica può essere eseguita in 90 minuti se eseguita correttamente. Non dimenticate che lavorare con le sonde molecolari potrebbe essere estremamente pericoloso e la precursione. Tale uso dei guanti deve essere sempre preso durante l'esecuzione di questa procedura.