Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne Neuronen in zwei mikrofluidischen Kompartimenten anzuordnen, um eine verbundene neuronale Co-Kultur herzustellen. Dies wird erreicht, indem das mikrofluidische Gerät zunächst in PDMS nachgebildet und durch Plasmakleben verkapselt wird. Der zweite Schritt besteht darin, Polylysin innerhalb des mikrofluidischen Geräts zu strukturieren.

Dies wird erreicht, indem das Gerät mit Polylysin gefüllt wird, eine Wassermasse durch Verdunstung gebildet wird und dann eine Plasmabehandlung verwendet wird, um das freiliegende Polylysin zu entfernen und das Biomaterialmuster zu erzeugen. Verwenden Sie als Nächstes eine Spritze, um die Neuronen durch den mikrofluidischen Schaltkreis zu aspirieren, um die Anordnung einzelner Neuronen zu ermöglichen. Das Gerät wird in den Gewebekultur-Inkubator für Neuritenauswüchse gelegt, um die beiden Neuronenpopulationen zu erweitern und zu verbinden.

Der letzte Schritt besteht darin, mit einer Aspirationspumpe ein Kompartiment selektiv zu behandeln und die Ausbreitung von Materialien und Pathologien innerhalb des neuronalen Schaltkreises zu überwachen. Die Prozedur wird von Yayu Chang und Sarada vom ISIS-Labor vorgeführt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. kommerziell erhältlichen PDMS-Komponentenkammern, besteht darin, dass die Neuronen-Co-Kultur mit der Einzelzellposition für die Analyse einzelner Neuroalgorithmen vorbereitet wird.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten. Was ist zum Beispiel der Mechanismus, der der Vermehrung von Hyperphospho-verwandten Turmaggregaten bei der Alzheimer-Krankheit zugrunde liegt, oder wie man die Ausbreitung von Organismen im Gehirn infiziert? Die Technik eignet sich ideal für Hochdurchsatzanwendungen, da für jede Versuchsbedingung nur wenige hundert Neuronen benötigt werden.

Beginnen Sie den Vorgang, indem Sie das PDMS-Präpolymer gründlich mit dem Härter im Verhältnis 10 zu eins mischen. Als nächstes entgasen Sie das Gemisch in einem Vakuum und trocknen in der Regel 20 Minuten lang. Legen Sie dann den zweilagigen, mikrostrukturierten SU-Acht-Wafer auf eine 80 Grad Celsius heiße Platte und richten Sie die Polymerrahmen zu jedem Gerät auf dem Wafer aus.

Gießen Sie PDMS in den Rahmen und warten Sie eine Stunde, um eine vollständige thermische Aushärtung zu gewährleisten. Nach dem Aushärten nehmen Sie den Wafer von der Heizplatte und lassen ihn auf einer ebenen Fläche abkühlen. Verwenden Sie anschließend beim Tragen einer Schutzbrille ein starres Skalpell, um den Rahmen und das PDMS vorsichtig von einer Ecke aus vom Wafer zu entfernen.

Entfernen Sie die PDMS-Form vom Rahmen und verwenden Sie eine Schere, um das Gerät zu trimmen. Wenden Sie das verbleibende PDMS auf den gesamten Wafer an, um ihn während der Lagerung zu schützen. Beim Abziehen dieser PDMS-Schicht vom Wafer werden alle partikulären Verunreinigungen von der Oberfläche entfernt, um für das erneute PDMS-Formen vorbereitet zu sein.

Bereiten Sie nun die sechs Schnittstellenports mit einem drei Millimeter großen Biopsiestanzer vor, wobei die mikrostrukturierten Merkmale nach oben zeigen, um die Ausrichtung der Ports mit den mikrofluidischen Kanälen zu erleichtern. Untersuchen Sie das Gerät auf Partikel und entfernen Sie diese mit reversiblem Klebeband. Bereiten Sie als Nächstes eine dünne PDMS-Schicht vor, die auf einem gläsernen Deckglas montiert ist, indem Sie eine kleine Menge der PDMS-Härtungsmittelmischung auf die Petrischale gießen.

Drücken Sie einen Deckglas auf die PDMS-Ebene. Legen Sie es auf die Herdplatte und härten Sie es ca. 10 Minuten thermisch aus. Kurz nach dem Abkühlen und mit Schutzbrille das Deckglas mit einem Skalpell bestücken.

PDMS-Doppelschicht aus der Petrischale, um das Gerät zu verkapseln. Eine gute P-D-M-S-P-D-M-S Anleihe wird benötigt. Legen Sie die PDMS-Doppelschicht und das mikrofluidische Gerät für 40 Sekunden in den Plasmaofen.

Nach der Plasmabehandlung drücken Sie beide Teile zusammen und lassen Sie sie kurz nach dem Plasmakleben von 0,5 Mikrolitern Polylysin in die untere mittlere Öffnung vollständig verbinden. Der gesamte mikrofluidische Kreislauf sollte durch Kapillarwirkung innerhalb von Sekunden gefüllt werden. Lassen Sie es dann einige Minuten einwirken, um die hydrophilen PDMS-Oberflächen vollständig mit Polylysin zu beschichten.

Anschließend wird das ungebundene Polylysin durch aspirationsgetriebenes Waschen entfernt. Verwenden Sie eine Vier-Wege-Verbindung, um die Pumpe mit den oberen drei Anschlüssen mit gleich langen Schläuchen zu verbinden, und starten Sie die Aspiration. Geben Sie PBS in die unteren drei Anschlüsse und waschen Sie sie eine Minute lang. Nehmen Sie anschließend den Schlauch ab und entfernen Sie alle PBS-Reste von den Anschlüssen.

Übertragen Sie das Gerät in ein Mikroskop und erhitzen Sie es mit Beleuchtung, um die Verdunstung aus den Anschlüssen zu erhöhen und eine schnelle Wassermaskenbildung zu ermöglichen. Überprüfen Sie das Gerät mit der Mikroskopie, um sicherzustellen, dass die Wassermaskierung vollständig ist. Führen Sie dann Edelstahlstifte in die Anschlüsse ein, um das von einem tragbaren Koronaentladungsgenerator erzeugte Plasma in die freien mikrofluidischen Kanäle einzukoppeln.

Richten Sie die Spitze der Plasmaquelle in die Nähe der Spitze eines Stifts und des Plasmas. Behandeln Sie den Mikrokanal eine Sekunde lang. Entfernen Sie anschließend die Stifte und verbinden Sie die drei oberen Anschlüsse mit der Pumpe.

Starten Sie die Aspiration und geben Sie PBS in die unteren drei Ports ab. Um PBS durch den mikrofluidischen Kreislauf zu ziehen. Entfernen Sie alle PBS aus dem mikrofluidischen Kreislauf und lassen Sie sie über Nacht einwirken, um die Strukturierung des Biomaterials abzuschließen.

Hier wird das Muster mit Hilfe von Polylysin visualisiert, das mit Fluorescein markiert ist. Grundieren Sie bei diesem Verfahren das Gerät mit geeigneten Medien, indem Sie 20 Mikroliter zu jedem der unteren drei Anschlüsse hinzufügen. Verwenden Sie dann eine parallele Aspiration aus den oberen drei Anschlüssen, um den mikrofluidischen Kreislauf schnell mit Medien zu füllen.

Geben Sie 20 Mikroliter einer disaggregierten Zellsuspension in jeden der flankierenden unteren Ports. Verwenden Sie eine Spritze, um vorsichtig aus den oberen drei Anschlüssen zu saugen. Ein vollständiges Neuron Orang dauert in der Regel eine Minute.

Dann mit einer Pipettenentnahme verbleiben überschüssige Neuronen in den Anschlüssen für einen Ring in nachfolgenden mikrofluidischen Geräten. Dieses Beispiel zeigt, wie Neuronen mit Einzelzellgenauigkeit angeordnet werden. Tauchen Sie das Gerät danach in Medien und legen Sie das Gerät in den Inkubator, damit die Zellen innerhalb weniger Stunden vollständig am Biomaterialmuster haften können.

Wie bei normalen Kulturen sollte das Medium regelmäßig aufgefüllt werden, um entweder das Neuronenkulturkompartiment oder das zentrale Neuroauswuchskompartiment selektiv zu behandeln. 20 Mikroliter der Prüfsubstanz werden in den unteren Anschluss gegeben, der mit dem interessierenden Kanal verbunden ist, und aus dem direkt darüber liegenden Anschluss aspiriert. In diesem Beispiel wurde eine selektive Behandlung auf das zentrale Kompartiment angewendet, und in diesem Beispiel wurde das flankierende Kompartiment behandelt.

Die Behandlungen wurden in einer Minute eingeleitet und 60 Minuten lang aufrechterhalten. Die Neuronen-Cokulturen können dann überwacht werden, um die Vermehrung von Materialien oder die Pathologie zu messen. Einmal gemeistert, können viele mikrofluidische Geräte an einem einzigen Morgen vorbereitet werden.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie die minimalistischen neuronalen Kulturen in Ihren eigenen Laboren vorbereiten und diese nutzen können, um die Mechanismen zu untersuchen, die der Material- und Krankheitsausbreitung im Gehirn zugrunde liegen.