siRNA的筛选识别泛素和泛素样系统压力表生物学途径在培养的哺乳动物细胞

该程序的总体目标是以 HF one alpha 依赖性缺氧反应为例，确定泛素的新成分和泛素样修饰系统在生物途径中的参与。这是通过首先优化报告细胞系对环境刺激缺氧的反应来实现的，因此它们适合进行筛选。该过程的第二步是建立高低对照，以提供适合筛选的 Z 因子。

建立参数后，一式三份执行初级 irna 筛选，然后通过二级和三级反卷积筛选确认命中。最终，结果可以揭示相关生物途径的新泛素和泛素样系统调节因子。与全基因组 Irna 筛选等现有方法相比，该技术的主要优点是靶向筛选更快、更容易执行、成本更低，并且仅报告研究者最感兴趣的生化途径成员。

U2 O-S-H-R-E 报告细胞系的缺氧反应性在含有 10% FBS 的 DMM 中准备好了 2 75 厘米见方的细胞。当细胞达到 80% 至 90% 汇合时，从一个培养瓶中吸出培养基，并用 10 毫升 PBS 洗涤这些细胞两次。胰试对细胞进行茴香处理，并将其重新悬浮在含有 10%FBS 的 8 毫升 DMM 中，用移液管使细胞均匀，平均获得两次细胞计数，然后将细胞稀释至每毫升 60， 000 个。

接下来，使用多通道移液器，将 6， 000 个细胞添加到三列（每列 5 个白壁 96 孔检测板）中，在孵育时将 5 个板孵育过夜，以克服边缘效应。第二天结束时，在板的底部放一张湿的薄纸，并在一堆板子上放一个坚硬的透明塑料袋。注意时间并将一块板转移到设置为 1%氧气的缺氧工作站。

然后在孵育开始后 14、18 和 22 小时将板移至缺氧工作站。接下来，配制 30 毫升荧光素酶裂解缓冲液。在添加 Lucifer 和焦磷酸钠之前，确保 BSA 在缓冲液中溶解至少 30 分钟。

在第一版板后 24 小时，卸载缺氧工作站，向检测板的每个加载孔中加入 100 μL 制备的缓冲液，以彻底去除细胞。用透明薄膜盖住板并摇晃 10 分钟。现在以 500 RPM 的速度，将堆叠中的板转移到软件中的自动读板器中。

选择实验方案菜单，然后选择 BS 5 95。然后在孔选择菜单下突出显示所有要读取的孔。单击 run 函数并计算每个板的平均报告基因活性。

然后将数据标准化为未经缺氧处理的板读数。对缺氧的强烈反应对于测定至关重要，并且报告活性增加 10 倍非常出色。继续设置控件并计算 Z 因子。

酸发展阶段是筛选过程中最关键的部分。细胞系的稳健表型反应与良好的高端低对照相结合非常重要。这将确保 IRNA 筛查成功。

使用 96 孔格式一式三份执行初筛。7 个汇合的细胞瓶就足够了。首先在通风橱下解冻 SI RNA 泛素文库的稀释系列至少 30 分钟。

接下来，用四个 200 微升的 200 纳摩尔 SI 重复制作一个主对照板。RNA 的。上样 4 个高对照孔、4 个低对照孔、4 个仅缓冲液对照孔和 4 个非靶标 IRNA 对照孔。下一个标记，对照柱之间的 17 个白壁分析板。

每个孔都加载了一组靶向相同 mRNA 的 4 个 siRNA。为确保主对照板和文库板中的溶液汇集到每个板的底部，请在 2000 gs 下充分旋转板一分钟。然后使用自动分液器将母板中的每个对照孔转移 10 μL 到标记的 17 个板中的每一个。

接下来，使用自动分液器将每个 SI RNA 库的 10 μL 从文库板转移到检测板中。使用分液器按预定比例制备 40 mL 转染试剂，将 10 μL 转移至 17 个检测板的每个孔中。40 毫升为分液器系统提供足够的死体积。

上样转染试剂后，以 500 RPM 的转速摇动板 1 分钟。然后让它们孵育 20 至 60 分钟，以形成 S-I-R-N-A 转染试剂复合物。现在用 10 毫升 PBS 洗涤 2 个 75 厘米方形培养瓶的 U2 O-S-H-R-E 细胞。

然后用胰蛋白酶茴香化细胞，将它们重悬于 8 毫升含 FBS 的 DM EM 中，将两个细胞集合混合在 50 毫升塑料管中。然后像以前一样计算细胞密度。使用该值以 75， 000/mL 的浓度制备 155 mL 细胞悬液。

该体积足以加载板并填充引擎盖下的分液器死体积。用磁力搅拌保持细胞搅拌。使用自动分液器将 80 μL 细胞加载到反应板的每个孔中。

每个反应都准备好了。Well 现在包含 100 微升，SI RNA 为 20 纳摩尔。记录时间并将板以 5 人一组的形式堆叠在 37 摄氏度的培养箱中。

在接下来的两天里，让板孵育 24 小时。开始这 17 个反应板的 2 个重复。转染转移后 24 小时，将反应板置于缺氧工作站。

将板在 1% 氧气下孵育 24 小时，以在第二天，即缺氧期结束前 2 小时诱导报告基因。像以前一样准备新鲜的荧光素酶裂解测定缓冲液，200 毫升足以用于 17 个板。从低氧环境中取出板后，使用自动分液器在每个孔中加入 100 μL 检测缓冲液。

然后用透明薄膜覆盖每个板，将它们装入摇床中，以 500 RPM 振荡 10 分钟。细胞将被彻底裂解。现在继续按照前面详述的方式读取印版。

分析一式三份采集的数据，并确定后续筛选所需的 irna。Greens U2 O-S-H-R-E 细胞包含一个萤火虫荧光素酶报告基因，该报告基因与缺氧反应元件的三个下游拷贝融合。这些元件与 HIF one alpha HIF one β 异二聚体结合，这些异二聚体在缺氧过程中丰富。

使用 I a 文库筛选之前使用概述的方案确定这些细胞的缺氧反应性。缺氧 24 小时诱导荧光素酶表达比基线增加 10 倍。Hi F1 alpha 和 FIH one I a 被选为低和高对照细胞。

用这些对照转染后，缺氧 24 小时后显示 10% 或 170% 的基线荧光素酶信号。接下来，用泛素 IRNA 文库转染细胞，并暴露于 1% 氧气 24 小时。在分析反应板时，每个板获得了大于 0.5 的理想 Z 因子。

使用散点图显示每个板的值，主屏幕记录了高和低控制之间的值。正如预期的那样，阳性和阴性 IRNA 调节因子的数量大致相等，而大多数对报告基因没有显着影响，二级和三级筛选继续了文本方案中给出的研究细节。观看本视频后，您应该对如何进行靶向 irna 筛选以识别调节您感兴趣的特定生物通路的泛素和泛素湖系统的成分有很好的了解。

从而为进一步调查提供了一个起点。