Hidrogel nanopartículas colheita de plasma ou urina para detectar proteínas de baixa abundância

O objetivo geral deste procedimento é colher, concentrar e preservar biomarcadores de baixa abundância e baixo peso molecular de fluidos biológicos em concentrações apropriadas. Para ensaios de proteínas padrão, isso é feito pela adição de nanopartículas de hidrogel quimicamente funcionalizadas ao fluido biológico, de baixo peso molecular. Os analitos entram no núcleo da nanopartícula e são capturados por diferentes corantes químicos orgânicos, que atuam como iscas proteicas de alta afinidade.

O segundo passo é separar as partículas do biofluido por centrifugação. As nanopartículas concentram as proteínas de interesse em várias ordens de magnitude. As nanopartículas são então lavadas com água para remover proteínas estranhas.

A etapa final é eluir as proteínas capturadas das nanopartículas. Em última análise, western blotting, espectrometria de massa ou ensaios de aminoácidos são usados para mostrar a presença e/ou concentração dos biomarcadores de baixa abundância colhidos anteriormente indetectáveis. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque as nanopartículas precisam ser lavadas e suspensas.

Sem entupir a ponta da pipeta, as nanopartículas não suspendem tão facilmente quanto uma célula P.So você deve pipetar vigorosamente para cima e para baixo para suspender adequadamente as nanopartículas após a primeira incubação. Com nanopartículas, é importante enxaguar as paredes do tubo para coletar qualquer resíduo de nanopartícula que possa ter aderido ao tubo. Para realizar o processamento de nanopartículas de amostras de soro, dilua 500 microlitros de soro humano um a dois com 50 milimolares tris, HCL pH sete em um tubo de microcentrífuga.

Adicione 500 microlitros de poli e isop propil acrilamida ou poli nipam co monômeros de nanopartículas de núcleo de ácido acrílico e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, gire a amostra a 16, 100 vezes G e 25 graus Celsius por 10 minutos. Em uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo, remova e descarte o SUP natin antes de adicionar 500 microlitros de tiocianato de sódio ao pellet, ressuspenda as nanopartículas pipetando vigorosamente para cima e para baixo várias vezes.

Gire a amostra como antes e descarte o sobrenadante antes de adicionar 500 microlitros de água mili Q ao pellet de nanopartículas. Mais uma vez, o resus suspende as nanopartículas pipetando vigorosamente para cima e para baixo várias vezes. Depois de girar a amostra novamente, eu tinha 300 microlitros de eluciana fresca, tamponamento e ressuspensão usando a técnica demonstrada.

Incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Após uma centrifugação final da amostra, remova e guarde o EIT em um tubo de microcentrífuga rotulado limpo. Eluir uma segunda vez e combinar os dois EITs em uma microcentrífuga. Dois.

Em seguida, seque os EITs sob fluxo de nitrogênio e um coletor evaporador de nitrogênio a 42.1 graus Celsius com fluxo de ar definido para seis. Armazene o EIT seco em temperatura ambiente para armazenamento durante a noite ou adicione 20 graus Celsius negativos para armazenamento de longo prazo antes da espectrometria de massa, Western blotting ou ensaios EISA para realizar o processamento de nanopartículas de amostras de urina. Colete um volume mínimo de 22 mililitros e armazene as amostras a 80 graus Celsius negativos até que estejam prontas para análise.

Descongele a urina congelada em temperatura ambiente ou a quatro graus Celsius durante a noite. Depois de descongelado, misture brevemente em um misturador de vórtice. Em seguida, despeje pelo menos 22 mililitros de urina em um tubo de polipropileno cônico de 50 mililitros.

Em seguida, gire a urina em uma centrífuga com um rotor giratório a 3.700 vezes G por 15 minutos sem perturbar o pellet. Transvase a urina para um tubo limpo de polipropileno de fundo cônico de 50 mililitros e descarte o pellet. Realize o exame de urina usando uma tira reagente de tira reagente de urina multianalita.

Coloque a tira de reagente voltada para cima em uma toalha de papel limpa e seca. Use uma pipeta descartável para aspirar um mililitro da urina. Dispense rapidamente uma a duas gotas de urina em cada almofada de teste da tira reagente.

Inicie imediatamente um temporizador previamente definido para dois minutos no horário indicado no recipiente da tira de reagente. Registre os resultados qualitativos para os vários analitos na tira de reagente, comparando a cor das tiras de reagente individuais com os indicadores codificados por cores correspondentes no recipiente de reagente. Os resultados normais típicos da urina são caracterizados por um pH de 5,5 a 7,0 e uma gravidade específica de 1,001 a 1,020.

A urina deve ser negativa para proteína sanguínea, leucócitos, nitrito, glicose, cetona, bilirrubina e urobilinogênio. Em seguida, transfira 20 mililitros da urina clarificada para um tubo de polipropileno limpo de 50 mililitros com fundo cônico. Não perturbe nenhum pellet de detritos que possa estar no fundo do tubo de urina do qual você está removendo a urina.

Adicione 200 microlitros de nanopartículas à amostra de urina de 20 mililitros e misture brevemente em um misturador de vórtice. Em seguida, incube a mistura de nanopartículas de urina por 30 minutos em temperatura ambiente sem balançar ou misturar. Gire a suspensão de nanopartículas de urina em uma centrífuga equipada com um rotor giratório a 3.700 vezes G por 10 minutos.

Depois de remover e descartar o sobrenadante, adicione 500 microlitros de água Milli Q ao pellet de nanopartículas. Ressuspenda as nanopartículas pipetando vigorosamente para cima e para baixo várias vezes. Transfira a solução de nanopartículas para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro.

Em seguida, gire as nanopartículas em uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo a 16, 100 vezes G por 10 minutos. Remova e descarte o sobrenadante antes de repetir essas etapas com água. Para lavar as nanopartículas, adicione 20 microlitros de tampão de eluição fresco ao pellet de nanopartículas e ressuspenda as nanopartículas pipetando vigorosamente para cima e para baixo várias vezes.

Incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Gire as amostras de nanopartículas novamente antes de remover o snat sem interromper o pellet de nanopartículas e salvar o sobrenadante em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro. Descarte o pellet no lixo de risco biológico.

Coloque as amostras em um rack em uma capela de exaustão química. Abra as tampas e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Alternativamente, coloque as amostras sob fluxo de nitrogênio a 40 graus Celsius até secarem.

Adicione 15 microlitros de tampão de amostra de tris glicina SDS às amostras. Aqueça a 100 graus Celsius em um bloco de calor seco por cinco minutos com as tampas abertas ou até que o volume restante no tubo não seja superior a 20 microlitros. Coloque a tampa nos tubos e remova os tubos do bloco de calor.

A amostra pode ser armazenada a 80 graus Celsius negativos ou usada imediatamente para análise de Western blot a jusante. A eletroforese em gel 1D de coloração de prata demonstra a captura de nanopartículas e a concentração do fator de necrose tumoral alfa do plasma humano. A banda que representa o fator de necrose tumoral alfa está presente apenas nas nanopartículas EITs designadas pela letra P para partículas, mas não nas nanopartículas sobrenadantes Funcionalizadas com duas iscas químicas diferentes, ácido acrílico ou casca de núcleo VSA são capazes de colher várias concentrações de IL 17 do western blotting plasmático do sobrenadante e da nanopartícula.

O EIT demonstra claramente a presença de IL 17 na banda de 17,5 kilodalton no eit, mas não na nanopartícula de sobrenadantes. A coleta de amostras de urina pode revelar antígenos bacterianos e citocinas nesta página SDS manchada de prata. Análise de amostras de urina amostras nas pistas U quatro e U seis são EITs de nanopartículas de amostras de urina contendo RET ESAT seis, uma proteína associada a mycobacterium tuberculosis e IL duas citocinas A.

Essas proteínas são representadas pelas bandas proeminentes em 15 kilodaltons. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como as nanopartículas de gel podem ser usadas para colher, concentrar e preservar biomarcadores de baixo abandono em fluidos biológicos, ao mesmo tempo em que exclui moléculas abandonadas indesejadas, aumentando drasticamente a sensibilidade de detecção dos métodos analíticos atuais.