الإنتاج واستهداف الأحادي التكافؤ الكم النقاط

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير بروتوكول سهل وقابل للتعميم لإعداد النقاط الكمومية أحادية التكافؤ لتصوير جزيء واحد لبروتينات الغشاء المستهدف في الخلايا الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إدخال كمية متكافئة من ترابط قليل النوكليوتيد بولي فوسفو طويل إلى نقطة كمومية. يلف الحمض النووي الطويل النقطة الكمومية تماما ويمنع ارتباط جزيء الحمض النووي الثاني ، وبالتالي توليد نقاط كمومية أحادية التكافؤ حصريا وكميا. شكل منفصل.

إعداد التسلسلات التكميلية الحاملة للحمض النووي الوظيفية لاستهداف بروتينات الغشاء ذات العلامات المفاجئة المعبر عنها في الخلايا الحية. بعد ذلك ، تؤدي المعالجة المتسلسلة للخلايا الحية التي تعبر عن بروتينات الغشاء ذات العلامات المفاجئة مع بنزو غينيا ، الحمض النووي ، متبوعة بالنقاط الكمومية أحادية التكافؤ إلى وضع العلامات الانتقائية للمستقبل المستهدف. الخطوة الأخيرة هي تصوير توزيع البروتين المستهدف ومسارات الانتشار عبر الفحص المجهري الفلوري أحادي الجزيء.

في نهاية المطاف ، يتم استخراج المعلومات المكانية الزمانية الديناميكية في الوقت الفعلي للبروتينات المستهدفة في الخلايا الحية للكشف عن كيفية عمل الجزيئات المستهدفة في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذا النهج في تجميع النقاط الكمومية أحادية التكافؤ هي بساطتها وإمكانية الوصول إليها بشكل عام. على عكس العديد من الأساليب الأخرى التي تتطلب مهارات أو معدات خاصة ، فإن هذا النهج بسيط نسبيا.

نتيجة لذلك ، يجب أن يكون متاحا لأي مختبر ولأي تخصص. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بدأت أنا وزيفا في مناقشة كيفية دمج خبرتنا في تخليق الجسيمات النانوية للحمض النووي للتحكم بشكل أفضل في تفاعل الجسيمات النانوية. أجرينا تجارب مبدأ الموافقة الأولية معا خلال عطلة نهاية الأسبوع.

نحو متزايد ، نجحت تجربتنا الأولى. في هذا الفيديو، نستخدم النقاط الكمومية أحادية التكافؤ لدراسة ديناميكيات الجسيم الفردي لمستقبل الشق في خلايا الثدييات الحية. ومع ذلك ، يجب أن تجد هذه النقاط الكمومية أحادية التكافؤ فائدة واسعة لأي دراسات تتطلب تتبع جسيم واحد.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه ليست كل النقاط الكمومية المتاحة تجاريا متشابهة ، سواء من الناحية الهندسية أو الكيميائية. لذلك ، ستكون هناك حاجة إلى بعض التحسين. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية في نقل الطور الخاص بك ، وقد تكون خطوات إضافة الحمض النووي المتعلقة بالفوسفور الأول مخيفة للمختبر بدون خبرة في الكيمياء الاصطناعية المتعددة.

للبدء ، قم بتخفيف 200 ميكرولتر من محلول ميكرومولار واحد من النقاط الكمومية العضوية مع 400 ميكرولتر من الكلوروفورم في قارورة زجاجية سعة خمسة ملليلتر. اجمع بين هذه النقاط الكمومية مع مزيج من 400 ميكرولتر من محلول كلوروفورم بروميد الأمونيوم رباعي البوتيل 0.3 مولار ، و 36 ميكرولتر من بيك ثيول أنيق ورجها طوال الليل. ثم أضف 800 ميكرولتر من محلول مائي 0.2 مولار من هيدروكسيد الصوديوم ورجه لمدة 30 ثانية.

يحدث نقل الطور في غضون بضع دقائق يشار إليه بنقل الجسيمات الملونة إلى الطور المائي فوق الطور العضوي الأكثر كثافة. إذا تجمعت الجسيمات في مرحلة ثالثة بين المرحلتين المائية والعضوية ، فقم بزيادة وقت الحضانة باستخدام قرص pec. إذا ظلت المرحلة المائية صافية ، فإن النقاط الكمومية لم تنتقل بشكل مرحلي.

زيادة تركيز قرص pec للتخفيف من ضعف نقل الطور. بعد ذلك ، استرجع المرحلة المائية الملونة. ثم ركز النقاط الكمومية المجمعة مع عمود دوران الراكون إلى مليلتر واحد.

أضف محلول النقطة الكمومية المركز إلى cidex NEP 10 عمود مسبق متوازن مع 10 ملليمولار ثلاثية المخزن المؤقت يحتوي على 30 مللي مولار كلوريد الصوديوم. الرقم الهيدروجيني ثمانية يتخلص من النقاط الكمومية ب 1.5 مل من المخزن المؤقت للشطف عن طريق تدفق الجاذبية. تابع قياس تركيز النقاط الكمومية باستخدام التحليل الطيفي للامتصاص عند 350 نانومتر.

لتحضير نقاط كمومية مستهدفة أحادية التكافؤ أو تصنيع ثمانية حمض نووي فوسفو ، قم بإعداد مليلتر واحد من محلول النقطة الكمومية 100 أنو مولار في 10 ملليمولار ثلاثية المخزن المؤقت يحتوي على 30 مللي مولار كلوريد الصوديوم الأس الهيدروجيني ثمانية. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من محلول 100 نانومولار فوسفو IO ثمانية حمض نويا. بالتنقيط إلى النقاط الكمومية المائية لمدة دقيقة واحدة مع التحريك بقوة.

قلب أو ضع الخليط على شاكر لمدة تسع ساعات إضافية. قم بإزالة ما يقرب من 10 ميكرولترات من خليط النقاط الكمومية لتشغيلها على جل زراعي تحليلي. أيضا ، قم بإزالة تركيز مماثل من النقاط الكمومية غير المترافقة في الطور المائي.

ثم عند ما يقرب من ميكرولترين من ستة × المخزن المؤقت لتحميل المكالمات لزيادة كثافة المحلول. قم بتشغيل هاتين العينتين معا على جل AROS بحجم 0.8٪ في عازلة بايد الصوديوم لمدة 15 دقيقة عند 150 فولت. يجب أن تكون النتيجة نطاقا واحدا في ممر التحكم غير المترافق يهاجر بالقرب من البئر وشريطين في الممر مع نقاط كمومية مترافقة.

احسب كسر النقاط الكمومية غير المترافقة باستخدام الكثافة النسبية للنطاقين. ثم استخدم هذا الكسر لحساب الحجم الإضافي ل 100 نانومولار فوسفو ثمانية محلول DNA المطلوب لمطابقة عدد النقاط الكمومية الكمومية. كرر الإجراء مرة أخرى باستخدام هذا الحجم المحسوب أو حتى تنهار النقاط الكمومية المترافقة في نطاق واحد على الهلام مما يشير إلى الاقتران الكامل لجميع النقاط الكمومية.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من 10 مللي مولار كربوكسي. ربط ستة ألكان ثيول بالنقاط الكمومية أحادية التكافؤ المستهدفة المترافقة ورجها لمدة 10 دقائق. لإزالة الألكان البيجول الزائد ، أضف 0.5 مل من محلول النقطة الكمومية إلى ACE fitex knap خمسة أعمدة متوازنة مسبقا مع المخزن المؤقت elucian.

ثم اجمع النقاط الكمومية المستهدفة أحادية التكافؤ مع مليلتر واحد من المخزن المؤقت elu عن طريق تدفق الجاذبية. ركز النقاط الكمومية التي تم جمعها باستخدام عمود دوران مركزي. يمكن تخزين هذه النقاط الكمومية المستهدفة أحادية التكافؤ عند أربع درجات مئوية شهريا ، وأكلت النقاط الكمومية أحادية التكافؤ قبل تجربة التصوير مباشرة باستخدام كواشف مثل الكازين أو خلايا صفيحة الألبومين في مصل الأبقار التي تعبر عن بروتين علامة المفاجئة على الانعكاس الداخلي الكلي أو التألق أو زجاج عالي الجودة.

في هذه التجربة بالذات ، نستخدم خط خلية U2 OS يعبر عن مستقبل واحد مميز بالنقاط والأسطح الزجاجية عالية الجودة بعد أن تلتصق الخلايا بالزجاج ، وإزالة وسائط النمو وغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS. ثم احتضان الخلايا لمدة 10 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في PBS أو وسائط الخلية التي تحتوي على البنزويل غينيا الحمض النووي ، المحضر كما هو مفصل في بروتوكول النص بعد الحضانة باستخدام benzo Guin ، DNA ، اغسل الخلايا بعناية باستخدام PBS أو وسائط الخلية ، ثم احتضان الخلايا لمدة خمس إلى 10 دقائق تقريبا مع النقاط الكمومية أحادية التكافؤ. اغسل النقاط الكمومية أحادية التكافؤ غير المنضمة وأعد الخلايا إلى مخزن مؤقت أو وسائط مناسبة لكل من التصوير وصورة الثقافة.

الخلايا التي تستخدم مجهر العشب بسبب سطوع النقاط الكمومية أحادية التكافؤ بجمع الصور بمعدلات إطارات عالية في العشب أثناء تصوير الجانب القاعدي للخلية الحية. بمجرد أن يتم طلاء النقاط الكمومية بالحمض النووي سالب الشحنة ، يجب أن تهاجر على مادة هلامية بشكل منفصل عن النقاط الكمومية غير المصابة باستخدام حصة من النقاط الكمومية غير المغلفة كعنصر تحكم. يجب أن يظهر نطاق ترحيل ثان أسرع عند إضافة Phosphol IO ثمانية DN. يظهر التكوين الكامل للنقاط الكمومية أحادية التكافؤ مع فقدان النطاق غير المتحرك وانهيار في النطاق المتحرك.

إذا تم ترحيل حصة من منتج النقاط الكمومية أحادية التكافؤ كنطاق واحد قابل للفصل عن النقاط الكمومية غير المغلفة ، فإن النقاط الكمومية هي بالفعل أحادية التكافؤ وجاهزة للاستخدام في خطوات أخرى. يظهر هنا وضع العلامات التمثيلية للخلايا التي تعبر عن بنية الكرز M ذات الشق المفاجئ بتركيزات مختلفة من النقاط الكمومية أحادية التكافؤ. النقاط الكمومية أحادية التكافؤ المخملة باستخدام PEG 12 مترجمة مع M cherry التي تشير إلى وضع علامات محددة.

يفضل بشكل عام كثافات الملصقات المنخفضة لتتبع الجسيمات الفردية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع جسيم نانوي فلوري أحادي التكافؤ معياري ساطع ومستهدف بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في إعدادين للبيانات للنقاط الكمومية أحادية التكافؤ ووضع العلامات على خلية الصور لمدة ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. من المهم أن تتذكر أنه باستخدام كواشف البداية المتاحة تجاريا ، يمكننا إنتاج نقاط كمومية أحادية التكافؤ ذات خصائص فيزيائية ممتازة للصور يمكن استخدامها لتجارب تتبع الجسيمات المفردة الطويلة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تصنيف البروتينات الأخرى باندماج العلامات المفاجئة لمتابعة ديناميكياتها الجزيئية على الخلايا الحية. قد يكون العمل باستخدام النقطة الكمومية أمرا صعبا للغاية ، لذلك لا تنس ارتداء قفازات نظارات واقية ومعاطف مختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.