Name: 3 차원 세포 배양 모델의 질량 분석 이미징을위한 준비 전략 샘플 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 배우세요 3차원 세포 배양을 질량 분석 이미징에 적합하게 준비하는 방법을 gelatin 임베딩과 cryostat 슬라이싱을 통해. 이 기술은 단일 실험에서 단백질, 지질, 대사물질을 무표지 검출하여 암 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 발터 암 재단(Walther Cancer Foundation)의 지원을 받아 노트르담 대학교 하퍼 암 연구소(Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame, DARW)의 기초 암 연구 발전(Advancing Basic Cancer Research) 프로그램과 피츠버그 분석 화학자 협회(Society for Analytical Chemists of Pittsburgh, ABH)의 2011 스타터 그랜트(Starter Grant)의 지원을 받았습니다. 유용한 토론을 해주신 질량 분석 및 단백질체학 시설(Mass Spectrometry and Proteomics Facility)의 직원들에게도 감사드립니다.

이미징 1. 3 차원 세포 배양 및 준비 <ol><li> 적절한 배양 세포주, 즉, HCT116 결장암 세포 라인, 2 차원 단층 배양에서. </li><li> 일반적으로 몇 일이 소요 50~70%의 자랄, 때까지 5 % CO 2 배양기에서 + 10 % 소 태아 혈청 맥코이의 5A 미디어와 T-25 플라스크에 HCT 116 세포를 성장. </li><li> 0.25 % 트립신 EDTA 용액으로 분리하고 세포를 이용하여 혈구 세포의 일부를 카운트하고 세포 밀도와 생존을 확인하기 위해 트리 판 블루 염색. </li><li> 카운팅 후 / 웰의 세포를 6,000 적절한 파종 밀도를 달성하기 위해 세포를 완전 배지로 희석, 또는 30,000 세포 / ml. </li></ol> 2. 아가로 오스 96 웰 플레이트를 코팅를 준비 <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브 표준 용지 10 ㎖ (미디어 1.5 % 아가로 오스 용액) 10 아가로 오스의 0.19 g을 추가합니다. 부드러운 혼합하여 통합을 확인합니다. 수욕 아가 압력솥20 분. </li><li> 평평한 바닥 96 웰 플레이트 문화 판의 60 중앙 우물에, 아가로 오스 + 미디어 혼합물의 대기음 50 μl를 멀티 채널 피펫을 사용. 판의 주변 가장자리에 우물이 약간 더 높은 증발 요금을 제공하고 있으므로, 200 μL 1X 인산염 완충 식염수 (PBS) 대신이 가장자리에 아가로 오스를 추가합니다. </li><li> 아가 혼합물 내부 웰에 추가되면, 옆으로 냉각 플레이트 세트 ~ 37 세포의 추가하기 전에 C를 °. </li></ol> 3. 씨와 3 차원 문화 경향 주 : 더 많거나 더 적은 세포가 관여 문화의 요구 사항에 따라 시드 할 수도 있지만, 이러한 조건은 배양 10-14 일 후에 직경 1mm 정도의 3D 세포 배양 구조 초래할 것으로 판정되었다 (데이터 미기재) . <ol><li> 해당 셀 솔루션의 200 μl를 추가로 (~ 6000 세포를 포함 희석) 아가로 오스 코팅96 웰 플레이트. 커버 플레이트 및 세포 성장 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 가습 설정. </li><li> 세포 매체마다 48 시간의 최소 변경, 또는 미디어가 나타날 때 색상을 변경합니다. <ol><li> 조심스럽게 아가로 오스의 하단에 (하루 2 육안으로) 작은 3 차원 세포 배양 주위에서 이전 미디어를 흡입하여 미디어를 변경합니다. 부드럽게 3D 세포 배양을 통해 새로운 매체의 200 μl를 추가합니다. </li><li> 이러한 미디어 변경시 (선택 단계), 테스트를 위해 화학 요법 또는 다른 약물을 추가합니다. 전체 미디어와 최종 농도 선택의 약물을 희석하고, 각 웰에 필요한 200 μl를 추가합니다. </li><li> 3D 세포 배양 직경 약 1mm가 될 때까지, 광학 현미경으로 3 차원 세포 배양 증가를 모니터링. </li></ol></li></ol> 4. 수확 3D 세포 배양 <ol><li> 부드럽게 아가로 오스의 침대에서 3D 세포 배양을 제거하기 위해 2 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다. </li> &lt;리&gt; 부드럽게 대기 24 웰 플레이트에서 약 1 ml의 PBS로 피펫 팅하여 PBS로 3 차원 세포 배양을 씻으십시오. </li><li> 전송 단백질 또는 대사 추출 원심 분리 튜브에 피펫을 통해 3D 혈청 세포 배양을 수확하거나는 이미징 애플리케이션을위한 슬라이싱 돕기 위해 절단 매체에 임베드. </li></ol> 젤라틴 5. 퍼가기 3D 세포 배양 <ol><li> 고순도 물 ~ 175 ㎎ / ㎖ 젤라틴 용액을 준비합니다 (18 MΩ 선호). (22, 23)는 적극적으로 젤라틴을 섞는다. 점성 및 조작하기 어려워지고 솔루션을 관찰한다. 용액 대기음 손쉽게 분명해질 때까지 ~ 60 ° C에서 수욕 젤라틴 함유 원뿔 관을 삽입하고 따뜻한. 참고 : 따뜻한 젤라틴 용액의 온도가 내려 가면으로 빠르게 경화, 급속히 동결하기 전에 다음 단계를 모두 수행합니다. </li><li> 이 가열 된 후, 세포 배양 후드 즉시 젤라틴 걸릴. BEA에서 젤라틴으로 튜브를 유지약 60에서 데워진 물 KER 젤라틴 용액의 경화를 방지하기 위해 C를 °. </li><li> 2 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여, 24 바닥이 평평한 판의 우물에 따뜻한 젤라틴 용액 0.6 ml에 입금. 이 볼륨은 얇은 층 바닥을 커버하기에 충분하다. 부드럽게 즉시 3D 구조를 파열 피하기 위해 다른 2 ㎖를 피펫을 사용하여 젤라틴 층의 상부에 3 차원 세포 배양을 침착. 참고 : 케어는 젤라틴으로 PBS를 배치하지이 단계에서주의해야합니다. 이 경우, 그러나, 200 μL 피펫을 사용하여 젤라틴의 상부로부터 PBS를 제거. </li><li> 3D 세포 배양은 젤라틴 층의 표면에 배치 된 후 배양의 위치를​​ 방해하지 않도록주의해서, 3 차원 세포 배양을 통해 따뜻한 젤라틴 혼합물을 또 다른 0.6 ㎖를 피펫. 두번째 층이 배치 된 후에, -80 ° C에서 젤라틴 매립 차원 세포 배양을 동결. </li></ol> 6. 조각과 해동 마운트 번째전자 질량 분석 이미징을위한 3 차원 세포 배양을 젤라틴 내장 <ol><li> 냉동실에서 3 차원 세포 배양을 포함하는 24 웰 플레이트를 제거합니다. 트위터 나 메스가 잘의 측면 아래로 부드럽게 미끄러 때까지 손에서 열 함께 접시의 바닥을 따뜻하게. </li><li> 부드럽게 중심을 해동하지 않고 젤라틴을 확보, 트위터 또는 메스를 밀어 넣습니다. 저온 유지 장치 지원에 물 한 방울을 가지고 지원 젤라틴 디스크를 부착 할 때 사용합니다. <ol><li> 젤라틴에 포함 된 3 차원 세포 배양은 -30 ° C에서 슬라이스에 가장 의무가 있습니다. 사용하기 전에 70 % 에탄올로 저온 유지 장치 블레이드와 유리를 청소합니다. 블레이드 또는 블레​​이드의 둔하게 방지하기 위해 각 3D 세포 배양 젤라틴 디스크의 새로운 블레이드의 다른 부분을 사용합니다. </li></ol></li><li> 3 차원 세포 배양이 표시 될 때까지 저온 유지 장치를 사용하여 부드럽게 초과 젤라틴을 직면하고있다. </li><li> 이 시점에서 천천히 12 ~ 16 μm의 섹션에서 부드러운 움직임과 3D 세포 배양 슬라이스. 주 : 슬라이싱에 중요한 요인이므로 이들 모두 일관된 결과를 보장하기 위해 점검해야 블레이드 유리의 거리, 날개 각, 저온 유지 장치의 온도, 지지체 상에 디스크의 각도를 포함한다. </li><li> 조심스럽게 조각을 해동하고 적절하게 레이블 인듐 티타늄 산화물 (ITO) 코팅 된 유리 슬라이드에 그들을 탑재하고 데시 케이 터에 보관하십시오. 최대 품질을 가능한 한 빨리 조각을 사용합니다. </li></ol> MALDI 이미징 7. 매트릭스 응용 프로그램 및 샘플 준비 <ol><li> MALDI 이미징에 앞서, 적절한 매트릭스와 슬라이스를 준비한다. <ol><li> 작은 분자 분석의 경우, 세척 단계는 일반적으로 필요하지 않습니다. 그대로 단백질 검출을 위해, 차가운 100 % 아세톤의 조각을 씻어 Carnoy의 유체, 또는 70 % / 95 % 이소프로판올는 신호를 마스크 할 수 지질으로 작은 분자를 제거하기 위해 24 일 -. (26) </li><li> 부드럽게 한 번에 더 이상 30 초 동안 세척한다. 하지 마십시오어떤 조각을 방해합니다. </li></ol></li><li> 0.1 % TFA와 함께, 유기 용매 및 물의 용액에 매트릭스를 준비한다. 이러한 α - 시아 노 -4- 히드 록 시신 남산 (CHCA)와 같은 작은 분자를 들어, 60 % ACN을 사용 : 40 % H 2 O : 0.1 % TFA (10 ㎎ / ㎖). 단백질 검출을위한 이러한 sinapic 산 (30 ㎎ / ㎖)로서, 동일한 용매 용액을 사용한다. sinapic 산 최적의 용해도를 들면, TFA의 첨가하기 전에 먼저 용해 아세토 니트릴 : H 2 O 용액. 다른 행렬이 적절하게 사용될 수있다. 주 : 매트릭스는 여러 가지 방법이 적용될 수 있지만, 어떤 행렬이 불가능한 시료 렌더링, 예컨대 페룰 산 젤라틴과 협력 crystalize 밝혀졌다 주목해야한다. 작은 결정이 감지 및 생물학적 차이보다는 매트릭스 효과에 기인하기 위해 더 많은 분자 종을 허용, 더 일관성 질량 스펙트럼을 생산하고 있습니다. </li><li> 방법을 handspotting에 의해 행렬을 적용합니다. <ol><li> MATR의 0.5 μl를 적용 할 뾰족한 주사기를 사용하여IX의 3 차원 세포 배양 슬라이스 용액과 매트릭스 crystalize 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 또한, 에어 브러쉬 방법을 사용합니다. 매트릭스 솔루션을 상용 등급의​​ 에어 브러쉬를 입력합니다. <ol><li> 8-12 인치 (5 cm) 슬라이드에서 분무기를 잡고 조각에서 미세한 스프레이를 목표로하고 있습니다. 패스 사이에서 1 분 최고 결정 형성을 허용하는 행렬을 건조 할 수 있습니다. 에어 브러쉬의 최대 10 ~ 20 패스는 매트릭스 (22)의 최적의 층을 생성하는 데 필요합니다. </li></ol></li><li> 대안 적으로, 승화 법은 다른 상세 설. 25, 27 </li><li> 매트릭스없이 애플리케이션의 종래 방법의 MALDI-MSI에 적어도 30 분 동안 데시 케이 터에서 건조 슬라이드. 25 </li></ol> MALDI-TOF 시스템을 사용하여 8 MALDI-MSI 분석 (즉, AutoFlex III) 참고 :이 섹션은 MALDI-TOF 이미징 실험에 대한 매개 변수를 설정하기위한 지침과 조언이 포함되어 있습니다. 기능에 따라trument 제조 업체 및 소프트웨어 사용, 프로세스는 다를 수 있습니다. <ol><li> 안전하게 이미지에 ITO 코팅 된 슬라이드에 부착 된 3 차원 세포 배양 조각을 75mm × 25 mm 슬라이드를 개최했다 어댑터에 슬라이드를 장착한다. 악기에 슬라이드 어댑터를로드합니다. </li><li> 문제의 질량 범위에 대한 적절한 교정 표준을 선택하여 MALDI-MSI의 악기를 준비합니다. 소분자의 심문 사용될 매트릭스, α-CHCA 대응 검출 신호는, 하나의 공통의 캘리 그룹이다. 단백질의 분석을 위해, 관심있는 범위에서 공지 된 질량 기준 단백질 (즉, 유비퀴틴, 트립 시노 겐)이 선택되고 같은 캘리 3D 세포 배양에 인접하여 발견된다. 방법 개발을 진행하기 전에 악기를 보정합니다. </li><li> 촬상 이전에, 기기 제조업체가 제공하는 소프트웨어를 이용하여 원하는 질량 범위에 대한 데이터 수집 방법을 개발. 참고도 1 및 2작은 분자 및 단백질 촬상. 작은 분자 이미징의 경우, 가장 높은 질량 해상도 모드를 reflectron 사용합니다. <ol><li> 100 ~ 1000 m / Z 사이 8,000- 25,000m / Z 사이의 단백질 작은 분자 데이터 수집을위한 질량 범위를 조정합니다. 악기와 가장 높은 질량 분해능을 제공하면서 선택의 영역을 포함하는 질량 범위를 조정합니다. </li><li> 레이저 파워, 주파수 보정 용액과 가까운 &#39;희생&#39;차원 세포 배양을 이용하여 레이저 조각 샷과 스폿 사이즈의 수를 조정한다. 주요 기기 제어 소프트웨어에서 이러한 설정을 확인하십시오. 60 % 전력, 400 레이저 샷, 초소형 스팟 사이즈 : 추천 시작 지점으로 다음과 같은 설정을 사용합니다. 이러한 설정은 장치 및 방법에 따라 다르며, 각각의 특정 악기 고품질 스펙트럼을 수득 기기 파라미터를 최적화한다. 조절 될 수있는 다른 파라미터는 검출기 이득, 샘플 레이트, 및 전자 이득을 포함한다. 에스이미징 소프트웨어에 사용하기 위해이 방법을 집결지 (예., 자동 실행 방법은 FlexImaging가에 그리는 것). 참고 : 검출을 방해하지 않도록 관심의 질량 범위 아래 억제 이온 (다시 장비 제어에 있음). </li><li> 선택의 질량 범위 단백질 데이터 수집 방법을 개발. 위에 설명 된 동일한 단계를 수행하지만, 중간에 높은 질량 범위에 대해 약 3 kDa의 위, 선형 모드를 사용합니다. 참고 : 설정 작은 분자 방법에 사용되는 것과 다릅니다. </li></ol></li><li> 이러한 MALDI-TOF 브루 커 시스템 FlexImaging 같은 기기 제조사가 제공하는 영상 소프트웨어를 사용하여 특정 MS 설치 구 파라미터. <ol><li> 방법 이전의 개발 및 저장을 사용하여 새 이미지 파일과 폴더를 만듭니다. 래스터 자리 (단계 8.3.2 또는 8.3.3에 설치) 기기의 제어 방법을 설정 크기 (약 200 μm의 50 μm의 기본에서 변경) 및 포지 등의 악기 매개 변수를 선택3D 세포 배양 스캐닝하도록 기. </li><li> 차례로 각각에 레이저를 이동, 샘플에 세 적절한 가르쳐 포인트를 선택합니다. &#39;인쇄 화면&#39;을 사용하여 MALDI-TOF 레이저 제어 소프트웨어의 광학 사진을 얻습니다. 주 : 많은 이미징 소프트웨어 프로그램 &#39;티치&#39;스캐너 또는 종종 카메라 기기를 얻을 수있다 레이저가있는 소프트웨어에 시료의 광학 사진을 필요로한다. </li></ol></li><li> 이어서 이미징 소프트웨어 (안 기기 제어)에서 촬영 처리를 시작하고 각 슬라이스에서 질량 스펙트럼을 획득. 특정 지역에 현지화 된 대부분의 3 차원 세포 배양에서 대중과 다른 사람을 관찰한다. </li></ol> 9. 옵션 데이터 분석 방법 <ol><li> 표적 분석을 위해, 평균 질량 스펙트럼을 클릭하여 스펙트럼의 수동 분석을 수행하거나 (촬상 소프트웨어가 자동으로 특정 임계치를 초과하여 질량을 선택할 수 있도록 예를 들어., AB 봉우리) 상위 20 %의 임계 값을 비켜. 품질 관리 매트릭스 피크 분포 또는 평균 스펙트럼을 조사한다. </li><li> 이러한 R 또는 matlab에 수학적 소프트웨어에서 추출 된 데이터 세트와 통계 분석을 수행합니다. <ol><li> 선택의 소프트웨어에로드하는 ASCII 형식으로 읽을 수있는 텍스트 파일에 수출 단일 스펙트럼. </li><li> 여러 가지 소프트웨어 프로그램에 의해 28 읽는 mzML 형식의 ASCII, mzXML에 개별 스펙트럼을 변환 -. (31) 또는 분석 (.IMG) 형식의 파일, MRI와 같은 다른 이미징 애플리케이션에 사용되는 일반적인 형식으로 데이터를 내보낼 (32) 분석을 위해 두 오픈 소스 옵션 MSiReader 및 BioMap (32, 33)이다. </li><li> 파일이 소프트웨어에서 읽을 수있는 형식으로 내 보낸 후, 각각의 소프트웨어의 지침을 통해 데이터 집합을로드합니다. 로딩 후, 같은 기준 제거 및 정규화 (normalization), 취득 후 처리를 수행합니다. </li><li> 이 데이터 집합으로, 쓰레딩을 수행이러한 Matlab과 18로 소프트웨어 알고리즘에 내장 된 사용자 정의 스크립트 또는를 사용하여 계층 적 클러스터링의 주성분 분석과 같은 stical 치료. </li></ol></li></ol>

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이 기사는 Bruker Biospin이 후원하는 다중 모드 전임상 이미징에 대한 특별호의 일부입니다. 대표적인 결과를 얻는 데 사용된 MALDI-TOF 시스템은 Bruker AutoFlex III입니다.

위에서 설명한 방법을 사용하여 3 차원 세포 배양 및 성장 MALDI-MSI 분석 될 수있다. 때 적절. 9,10- 용품, 즉, 너무 많은 시간을 전달 통로 낮은 번호가되지 않은 세포를 배양하기 위해 취해 져야한다 배양 많은 불멸화 세포주를 3 차원 구조를 형성 할 것이다. 일반적으로, 10 및 하부 통로의 숫자와 함께 세포는 3 차원 세포 배양을위한 최적의 성장이다. 전통적인 아가 지원 3D 세포 배양 성장은이 시스템을 시도하는 3 차원 세포 배양 연구에 관심이있는 그룹을위한 비용 효율적인 방법을 제공한다. 이 방법은 없습니다 이미 대부분의 포유 동물 세포 배양 실험실에서 몇 가지 구성 요소를 사용합니다. 세심한주의가 성장을위한 아가로 오스 판의 준비에 지불해야하는 3 차원 세포 배양은 크기와 모양에 일치되도록; 주의를 필요로하는 일부 양상들은 기포가 혼합물과 적절한 메 니스 커스가 각 w 저부에 형성되어있는 것을 포획되지되는지 확인할엘. 메 니스 커스가 정상적으로 형성되지 않는 경우, 세포는 비 회전 타원체 형상 또는 작은 덩어​​리로 성장할 수있다. 또한,주의가 회전 타원체와 젤라틴으로 PBS를 배치하지 않도록주의해야합니다. 이 경우, 200 μL 피펫을 사용하여 젤라틴의 상단에서 PBS를 제거합니다. 비용 인자가 아닌 경우, 초저 결합 둥근 바닥 판은 시판되고 다음 단계의 단순화를 제공한다. 다른 조직 매립 방법은 고비용 및 비 질량 분석 호환 될 수 있지만, 젤라틴 임베딩 저렴하고 다양한 양쪽 것으로 밝혀졌다. 3D 세포 배양은 최고 품질 데이터를 획득하기 위해 위에서 설명한 제조 전략을 최적화되었다. 젤라틴 임베딩 질량 분광 분석과 호환되도록 도시 하였지만, 이러한 과정으로 인해 공동 결정화 가능한 매트릭스를 좁힐 않는다. 냉동 후에, 3 차원 세포 배양은 그들이 동결 해동하지 않는 한 달 동안 안정하다. 젤라틴 냉동 때 불투명하게하고, 3 차원 셀문화는 비슷한 색상의, 그래서 그것은 분할에 도움이 3D 세포 배양 배치를 문서로 동결하기 전에 것이 좋습니다. 슬라이드를 제조하는 경우, 행렬은 여러 가지 방법이 적용될 수 있지만 어떤 행렬 못할 샘플 렌더링, 예컨대 페룰 산 젤라틴과 협력 crystalize 발견되었다는 것을 주목해야한다. 작은 매트릭스 결정의 일관성 질량 스펙트럼을 생산하고 있습니다. handspotting 매트릭스 애플리케이션의 가장 간단한 방법이지만, 더 큰 용매 부피는 더 큰 결정 크기 및 상당한 검체 이동 될 수있다. 질량 분석기에서 시작 분석에 필요한 전문 지식을 감소 MALDI-MSI 기술의 발전. 데이터 수집 및 분석을 ITO 코팅 된 슬라이드로부터 고품질의 정보를 얻을 초보자도 허용 대부분의 시스템에 간단하다. 근처의 이미지가 아닌 가치있는 3D 셀이 배양에 최적화 된 기기의 매개 변수를주의 깊게 선택,ES, 고품질의 데이터를 얻는데 중요하다. 예를 들면, 레이저 파워의 증가는 피크 강도를 증가시킬 수 있지만, 레이저 파워를 낮추면 해상도를 더 향상시키고 피크 대칭 형상을 부여 할 수있다. 3D 세포 배양 샘플 최적의 품질을 보장​​하기 위해 나눈 다음, 신속하게 사용되어야한다. 단백질 신호의 저하는 (20 kDa의 이상), 특히 높은 질량 영역에서, 적절한 보관 (데시 케이 / -80 ° C 냉장고)없이 일주일 이내에 볼 수있다. 수요 증가로 인해, 많은 다른 시각화 소프트웨어 프로그램 개발 및 연구 공용 자유롭게되었다. 대부분의 이미징 질량 분석기는 각각의 기기에서 사용하는 고유의 형식으로 하나의 질량을 시각화하는 데 필요한 소프트웨어를 설치했습니다. 이러한 소프트웨어 프로그램은 데이터를 단일 질량 이미지를 획득하고 익스포트 할 수있다. 대부분의 소프트웨어는 또한 관심의 두 개 이상의 대중의 오버레이를 허용합니다. 또한, MSI 데이터에 대한 많은 다른 시청자는 MSi​​Reader의로, 무료로 다운로드 할 수 있습니다D BioMap. 또한 최전선에 더 많은 유용한 정보를 데리고 쉽게 취득 후 처리 될 수 있습니다 얻은 32, 33 질량 분석 데이터는. 지질 단백질에 제약으로부터, 위에서 설명한 시스템은 3 차원 세포 배양 구조 걸쳐 관심 분자의 분포를 평가하기위한 데이터의 빠른 획득을 허용한다. 직렬 섹션에서는 3D 세포 배양의 조각의 각각의 2D 이미지에서 구축하여 이미지에 전체 3D 구조를 취할 수 있습니다. 프로토콜의 기술 및 메모 단층 문화와 동물 모델 사이의 다리 세 가지 차원 세포 배양을 시작하고자하는 연구자들에게 유용 할 것입니다. 마스터되면, 이들 기술들은 선택하든 샘플 화상 연구자 있도록 3D 세포 배양, 조직 및 세포 배양의 여러 유형에 적용될 수있다.

질량 분석 이미징(MSI)은 관심 샘플에서 분자 종의 분포를 검사하는 강력한 기술입니다. 연구원들은 이 기술을 사용하여 전체 동물에서 단일 세포에 이르기까지 생물학적 샘플을 이미지화했습니다. 1–4 MSI를 사용하면 기존 컨포칼 현미경 검사를 위한 추가 형광단을 개발하거나 조직학을 위한 염색이 필요한 단일 기판 기술 대신 한 번에 수백 개의 분석물을 이미지화할 수 있습니다. 5–7 또한 MSI는 표적 또는 발견 기반 방식으로 사용할 수 있으므로 화학 종의 분포 간의 중복을 살펴보는 매력적인 접근 방식입니다. 여기에는 3차원 다세포 세포 배양의 작은 샘플(직경 ~1mm)의 성장, 준비 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화/탈착(MALDI) 이미징을 위한 방법이 나와 있습니다. 8–11
3D 세포 배양은 전통적인 단층 배양과 생체 내 종양 사이의 중개자로서 생물학 커뮤니티에서 특히 중요합니다. 이름에서 알 수 있듯이 3D 세포 배양은 작은 무혈성 종양 결절에서 관찰되는 미세환경의 많은 화학적 구배를 포함하는 이질적인 세포 응집체로, 단층 배양보다 네이티브 종양 환경에 더 현실적인 모델 시스템입니다. 10 결장, 유방, 난소, 전립선, 신장 및 폐 조직에서 유래한 세포주를 포함하여 많은 인간 세포주를 3D 배양으로 성장시킬 수 있습니다. 10 3차원 세포 배양 이미징은 질량 분석 이미징에 일반적으로 사용되는 많은 샘플보다 작기 때문에 신중한 샘플 준비가 필요하기 때문에 이미징에는 고유한 문제가 있습니다. 7 그러나 이러한 다루기 쉬운 모델 시스템의 장점은 동물 모델에 비해 비용이 저렴하고 성장 및 분석 시간이 빠르다는 것입니다. 결과적으로 3차원 세포 배양과 관련된 연구는 기존 동물 연구보다 처리량이 더 높을 수 있습니다. 12–14일
 이러한 모든 장점으로 인해 생물학 연구에서 3차원 세포 배양에 대한 인기가 높아졌습니다. 이러한 시스템에서 분자의 구성과 공간 분포를 모두 탐구하기 위한 새로운 분석 전략을 개발할 필요가 있습니다. 12,15–21 이 원고의 목표는 질량 분석 이미징 방법 및 샘플 준비의 3차원 세포 배양에 대한 적응을 설명하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>HCT116 세포주</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-247</td><td>잠재적 위험, 주의해서 다루십시오</td></tr><tr><td>McCoy의 5A 매체</td><td>Gibco</td><td>16600-108</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA 용액</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate 버퍼드 식염수</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴, 무향</td><td>Knox</td><td></td><td>대부분의 식료품점에서 단일 패킷</td></tr><tr><td>ITO 코팅 유리 슬라이드</td>로 구매 <td>가능 Delta Technologies, Limited</td><td>CG-90IN-S115</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>Sinapic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85429</td><td></td></tr><tr><td>0.3mm 중력 공급 듀얼 액션 에어브러시 페인트 스프레이 건 키트 세트</td><td>RoyalMax 에어브러시</td><td></td><td>다음과 같은 사이트에서 사용할 수 있는 다양한 옵션 Amazon.com</td></tr></tbody></table>

3 차원 세포 배양 모델의 질량 분석 이미징을위한 준비 전략 샘플

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

3차원 세포 배양은 생물학 연구를 위한 매력적인 모델입니다. 그들은 세포 배양의 유연성 및 비용 효율성과 조직의 공간 및 분자 복잡성을 결합합니다. 예를 들어, 많은 세포주가 적절한 체외 조건에서 3D 구조를 형성합니다. 대장암 세포주는 3D 세포 배양 스페로이드를 형성하며, in vitro는 무혈성 종양 결절을 모방합니다. 면역조직화학 및 기타 고전적인 이미징 방법은 특정 분석물의 분포를 모니터링하는 데 널리 사용되는 반면, 질량 분광 이미징은 편향되지 않은 방식으로 분자 클래스의 분포를 검사합니다. MALDI 질량 분석 이미징은 원래 인간 또는 동물 모델에서 얻은 샘플을 조사하기 위해 개발되었지만, 이 보고서는 샘플 준비 전략의 개선을 포함하여 체외 3차원 세포 배양 분석을 설명합니다. 여기에서는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화-질량 분석법(MALDI-MS) 이미징을 통한 3D 세포 배양의 성장, 수확, 절단, 세척 및 분석 방법에 대해 설명합니다. 대장암 3D 세포 배양을 모델 시스템으로 사용하는 이 프로토콜은 MALDI-MSI를 사용하여 3D 세포 배양 시스템 전반에서 편향되지 않은 방식으로 분석물을 모니터링할 수 있는 능력을 보여줍니다.

MSI 촬상 차원 세포 배양에서 다양한 분자량 분포를 공개하는 잠재력을 가지고있다. 위에서 설명한 방법을 사용하여, 작은 분자 큰 단백질 (도 1) (도 2)으로부터 종 배양에 걸쳐 추적 될 수있다. 이러한 결과는 MSiReader. 32 개 결과 관심 영역 또는 전체 스캔 영역의 어느 시각화 소프트웨어와 3D 세포 배양 관심 걸쳐 단일 이온에 대해 분석 될 수없는 공구 단일 이온의 시각화를 나타낸다. 또한 대부분의 소프트웨어는 자동 발견 노력을 도울 수도 사용자에 의해 설정된 소정의 임계 값 이상으로 이온을 시각화한다. 단일 이온지도가 얻어지면, 대부분의 소프트웨어는 이온의 colocalization을를 보려면 이미지를 오버레이 할 수있는 기능이 포함되어 있습니다. 하나의 접근 방법을 발견 기반 또는 타겟 방식으로, 질량 분석 이미징은 3 차원 세포 배양을 분석하는 강력한 도구입니다. 도 3d 세포 배양 및 성장 절편. 좌)에 수확 전 14 일째 보아 그대로 대장 HCT-116 세포 배양 3D 구조의 광학상의 1. 대표 결과. 오른쪽) 대장 3D 세포 배양 해동의 약 적도 슬라이스의 광학 이미지 이미징을위한 ITO 코팅 슬라이드에 장착. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> 그림 3 차원 세포 배양. TOP) 낮은 질량 (작은 분자) 범위에서 α-CHCA 달성 평균 질량 스펙트럼의 적도 부분의 작은 분자 MALDI-MSI 2. 대표 결과. 하단) 대표 이미지단일 질량 : 327.8 m / z는 주로 3 차원 배양 및 세포의 내부에 국소 429.7 m / 3D 주로 세포 배양의 에지에 Z 지역화. 점선은 회전 타원체의 대략적인 우위를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> 그림 3 차원 세포 배양. TOP) 이상 (단백질) 질량 범위에서 sinapic 산으로 달성 평균 질량 스펙트럼의 적도 부분의 MALDI-MSI에 의한 단백질 이미징 3. 대표 결과. 맨 아래) 하나의 질량의 대표 이미지 : 주로 회전 타원체의 가장자리에 지역화 10,871m / Z, 그리고 더 많은 회전 타원체의 내부를 향해 지역화 12,184m / Z. 점선 타원체의 가장자리를 나타내는 근사. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

불멸화 암세포 차원 세포 배양, 생물학적 연구를위한 유용한 모델로 성장시킬 수있다. 이 프로토콜은 샘플 제조 플랫폼의 개선을 포함하여 3 차원 세포 배양의 질량 분석 이미징을 설명한다. 이 프로토콜의 목적은 질량 분석 이미징 분석 3D 세포 배양을 준비하도록 지시한다.

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

이 절차의 전반적인 목표는 3차원 세포 배양물을 준비하고 질량 분석 이미징을 통해 분석하는 것입니다. 이는 먼저 3차원 세포 배양물을 구축하고 원하는 크기로 성장시킨 후, 두 번째 단계에서 3차원 세포 배양물을 회수하여 젤라틴에 임베딩함으로써 달성됩니다.다음으로, 크라이오스탯을 사용하여 영하 30 °C에서 3차원 세포 배양물을 절편으로 자른 후 전도성 슬라이드에 부착합니다. 마지막 단계는 MALDI MSI 장비를 사용하여 절편을 분석하고 검출된 분자들을 분석하는 것입니다. 최종적으로, 질량 분석 이미징을 통해 3차원 세포 배양 전반에 걸쳐 다양한 생체 분자 클래스의 분석물 분포 변화를 보여줍니다.기존의 질량 분석 현미경(mass like microscopy)이나 자기 방사법(auto radiography)과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 질량 분석 이미징(mass spec imaging)을 통해 항체 라벨링 없이 단 한 번의 실험으로 단백질, 지질 약물, 대사물질과 같은 여러 분석물을 검출하고 위치를 파악할 수 있다는 점입니다. 시연을 진행할 인원은 Dorothy Alf Wheat craft, 본인(포스트닥터), 그리고 Hamman 연구실의 대학원생 Shin Li입니다. 이 절차를 시작하기 전에, HCT 116 결장암 세포주와 같은 적절한 세포주를 2차원 단층 배양하십시오. 그 다음, 50 mL 원심분리 튜브(conical tube)에 담긴 10 mL의 표준 배지에 0.19 g의 aros를 첨가하십시오.부드럽게 혼합하여 완전히 혼입시킨 후, 멀티 파이펫 흡입기를 사용하여 수조에서 20분 동안 Agros 배지를 오토클레이브하십시오. 평평한 바닥의 96웰 배양 플레이트의 중앙 60개 웰에 Agros 배지 혼합물 50 µL를 분주합니다. 플레이트의 주변부 웰은 증발률이 약간 더 높으므로, 이러한 주변부 웰에는 Agros 대신 1x 인산완충식염수(PBS) 200 µL를 넣으십시오.aros 혼합물을 내부 웰에 첨가한 후, 세포를 추가하기 전 플레이트를 약 37°C로 냉각될 때까지 둡니다. 이때, aros가 코팅된 96-웰 플레이트에 적절한 세포 용액 200 µL를 넣고, 플레이트를 덮어 5% CO₂ 농도의 37°C 습윤 배양기에 넣어 세포를 성장시킵니다. 배양 후, aros 바닥의 작은 3차원 세포 배양물 주변에서 기존 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거함으로써 배지를 교체합니다.그런 다음 3차원 세포 배양 위에 200 µL의 신선한 배지를 조심스럽게 첨가합니다. 고순수(high purity water)를 사용하여 약 175 mg/mL 농도의 젤라틴 용액을 준비합니다. 용액이 점성이 생겨 조작하기 어려워지면 젤라틴을 격렬하게 혼합합니다.튜브를 약 60 °C의 항온수조에 넣고 용액이 투명해져 흡입하기 쉬워질 때까지 가온합니다. 2 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 24웰 평저 플레이트의 각 웰에 가온된 젤라틴 용액 0.6 mL를 분주합니다. 3차원 구조가 파괴되는 것을 방지하기 위해 다른 2 mL 피펫을 사용하여 세척된 3차원 세포 배양물을 젤라틴 층 위에 즉시 배치합니다.세포 배양물을 젤라틴 층 표면에 배치한 후, 세포의 위치가 흐트러지지 않도록 따뜻한 젤라틴 혼합물 0.6 milliliters를 그 위에 조심스럽게 피펫으로 분주합니다. 그 다음, 젤라틴에 내장된 3차원 세포 배양물을 minus 80 degrees Celsius에서 동결시킵니다.세포 배양물이 포함된 24-웰 플레이트를 냉동고에서 꺼낸 후, 핀셋이 웰의 측면을 따라 부드럽게 내려갈 수 있을 때까지 손으로 플레이트 바닥을 데웁니다. 그다음 핀셋을 디스크 주변으로 부드럽게 밀어 넣어 중심부가 녹지 않게 하면서 젤라틴을 분리합니다.크라이오스탯 지지대에 물 한 방울을 떨어뜨리고 젤라틴 디스크를 지지대에 부착합니다. 그런 다음 크라이오스탯에 넣어 동결시킵니다. 3차원 세포 배양물이 노출되도록 과잉 젤라틴을 깎아낸 후, 부드러운 동작으로 12 to 16 µm 두께로 천천히 절편을 만듭니다.절편이 해동되면 인듐 주석 산화물(ITO) 코팅 유리 슬라이드에 부착하십시오. 슬라이드에 라벨을 부착한 후, 온전한 단백질 검출을 위해 데시케이터에 보관하십시오. 신호 검출을 방해할 수 있는 지질과 같은 소분자를 제거하기 위해 절편을 차가운 아세톤으로 세척하십시오.유기 용매와 0.1% trichloroacetic acid가 포함된 수용액으로 매트릭스를 준비합니다. 끝이 뾰족한 시린지를 사용하여 3차원 세포 배양 절편 위에 매트릭스 용액 0.5 µL를 도포합니다. 매트릭스가 결정화되도록 둔 후, MALDI MSI 분석 전 데시케이터에서 슬라이드를 최소 30분 동안 건조시킵니다.이 시점의 분석을 위해, 75 mm x 25 mm 슬라이드를 안정적으로 고정할 수 있도록 제작된 어댑터에 슬라이드를 장착하여 3차원 세포 배양 슬라이스를 이미지화합니다. 그 다음, 슬라이드 어댑터를 기기에 로드합니다. 적절한 데이터 획득 방법을 설정한 후, 질량 범위를 소분자 데이터 획득의 경우 101,000 m/z로, 단백질의 경우 8,020 ~ 5,000 m/z로 조정합니다.그 다음, 교정 용액과 인접한 희생용 3차원 세포 배양 슬라이스를 사용하여 레이저 출력, 주파수, 레이저 샷 수 및 스팟 크기를 조정하십시오. 이 방법을 기기 제조업체에서 제공하는 이미징 소프트웨어에 저장하십시오. 앞서 설명한 대로 선택한 질량 범위에 대한 단백질 데이터 획득 방법을 개발하십시오.그 다음, 이미징 소프트웨어를 사용하여 특정 MS 기기 파라미터를 설정합니다. 기기 파라미터를 선택하고 3D 세포 배양물을 스캔할 위치인 기기 제어 방법 위치를 설정합니다. 이어서, 레이저를 각각 이동시켜 샘플에서 적절한 티치 포인트(teach point) 세 곳을 선택합니다.이어서, 프린트 스크린 기능을 사용하여 MALDI-TOF 레이저 제어 소프트웨어에서 광학 사진을 얻습니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어에서 이미징 프로세스를 시작하고, 표적 분석을 위해 각 슬라이스에서 질량 스펙트럼을 획득합니다. 평균 스펙트럼에서 질량을 클릭하여 스펙트럼의 수동 분석을 수행합니다.마지막으로, 수학 소프트웨어를 사용하여 추출된 데이터 세트에 대해 통계 분석을 수행합니다. 질량 분석 이미징은 3차원 세포 배양에서 다양한 분자 분포를 밝혀낼 가능성이 있습니다. 앞서 설명한 방법을 통해 소분자부터 거대 단백질에 이르는 종들을 배양 전반에 걸쳐 추적할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 질량 분석 이미징을 통해 3차원 세포 배양물을 준비하고, 절편화하며, 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

sample-preparation-strategies-for-mass-spectrometry-imaging-3d-cell

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기에서는 MS 분석을 위한 소형 다기능 장치인 단일 프로브를 사용하여 조직의 주변 질량 분석 이미징(MSI)과 현장 라이브 단일 세포 MS(SCMS) 분석을 모두 수행하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

단일 프로브의 응용 프로그램 : 주변 조건에서 질량 분석 이미징 및 단일 세포 분석

세포 및 조직 coculture 이미징 질량 분석을 사용 하 여 작은 분자 exchange 검색에 맞게 샘플 준비 하는 새로운 방법 개발 되었다.

조직 및 질량 분석 이미징 사용 하 여 셀 사이의 작은 분자 통신 캡처

통합 셀 조작 플랫폼은 주변 조건하에서 개별 현탁액 셀의 온라인 분석을 위한 단일 프로브 질량 분석 설정과 함께 사용하기 위해 개발되었습니다.

단일 현탁액 세포에서 약물 및 대사 산물의 질량 분석 분석을 위한 단일 프로브와 결합된 통합 셀 조작 플랫폼

여기에서 자사는 100μm에서 수 밀리미터 범위의 고정 3차원 세포 배양 모델의 염색 및 세포내 분해능 이미징을 수행하기 위한 상세하고 강력하며 보완적인 프로토콜을 제공하여 형태, 세포 유형 구성 및 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

3차원 오가노이드 및 스페로이드 모델의 염색 및 고해상도 이미징

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

여기서는 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포의 3D 바이오프린팅 공동 배양을 생산하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 하이드로겔 스캐폴드 내에서 96웰 또는 384웰 형식으로 생성된 이 공동 배양 모델은 7일 이내에 높은 인쇄 후 생존율과 신경돌기 성장을 입증하고 두 세포 유형 모두에 대한 성숙 마커의 발현을 보여줍니다.

스크리닝 응용 분야를 위한 인간 iPSC 유래 뉴런-성상세포 공동 배양의 3차원 바이오프린팅

이 프로토콜은 휘발성 염 용액 세척, 급속 액체 질소 담금질, 동결 건조 및 -8°C 저장을 결합하여 단일 세포 질량 분석법(SCMS)을 위한 세포 대사 산물을 보존하는 것을 목표로 합니다. 이는 액체 질소 담금질이 대사 산물 프로필을 유지하는 데 필수적이며, 대사 변화를 방지하기 위해 장기간 냉장 보관을 최소화해야 함을 보여줍니다.

단일 세포 질량 분석법 대사체학 연구를 위한 시료 전처리: 결합된 세포 세척, 담금질, 건조 및 보관

이 프로토콜은 탈착 전기분무 이온화와 Orbitrap 질량분석기를 결합하여 고공간 해상도 대사체 분석을 위한 OVCAR-8 세포의 단일 세포 질량분석법 영상을 설명합니다.

오비트랩 질량분석기와 결합된 해착 전기분무 이온화를 이용한 단세포 질량분석법 영상

배우세요 3차원 세포 배양을 질량 분석 이미징에 적합하게 준비하는 방법을 gelatin 임베딩과 cryostat 슬라이싱을 통해. 이 기술은 단일 실험에서 단백질, 지질, 대사물질을 무표지 검출하여 암 생물학 연구에 활용됩니다.

3 차원 세포 배양 모델의 질량 분석 이미징을위한 준비 전략 샘플

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