A-crítico tamaño femoral Defecto sencillo modelo en ratones

El objetivo general de este procedimiento es generar un defecto de tamaño simple, experimental y crítico en el fémur de un ratón. Esto se logra haciendo primero un clavo medular a partir de un tubo de acero quirúrgico. En el segundo paso, se genera un defecto de tamaño crítico en el fémur de un ratón anestesiado.

A continuación, se implanta el clavo para estabilizar el hueso. En última instancia, la radiografía y la histología se pueden utilizar para evaluar el grado de curación ósea. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurar el hueso solo con las pinzas actuales y asegurarse de que el collar esté enrasado con el borde del hueso cortado.

Comience colocando 10 microlitros de adhesivo de cianoacrilato en el centro del eje de una pieza de nueve milímetros de tubo hipodérmico de acero inoxidable de calibre 22. Pase un collar de tres milímetros sobre el eje hasta que llegue al centro y luego gírelo para distribuir uniformemente el pegamento entre el collar y el eje como se ilustra aquí. Se pueden crear prototipos de varias configuraciones de pines para los fines específicos del estudio y el destinatario.

A continuación, mida las dimensiones del pin con un par de calibradores digitales. Cada sección debe tener unos tres milímetros de largo. Deje que el collar se asiente durante al menos 15 horas y luego use dos discos impregnados de Emory de grano 20 para eliminar las rebabas o el exceso de pegamento.

A continuación, use una herramienta rotativa para pulir el alfiler con un disco pulidor de fieltro y luego enjuague el alfiler con agua desionizada y séquelo con aire comprimido. Ahora, pruebe la integridad colocando una aguja roma hipodérmica de calibre 19 sobre el eje del alfiler y empuje la aguja contra el collar para confirmar que el collar puede resistir aproximadamente 25 gramos de peso. A continuación, enjuague el clavo con PBS filtrado estéril y pruebe el ajuste deslizando el clavo en la cavidad medular femoral de una muestra de hueso, asegurándose de que el eje encaje perfectamente con el cuello al ras de los bordes del hueso cortado.

Asegúrese de que el extremo del clavo penetre también en el hueso de la trabécula de la diáfisis, para maximizar la fijación y mejorar el ajuste de interferencia. Perfora un cilindro de tres milímetros de espuma de gel con un cuchillo de biopsia de piel y perfora el centro con una aguja de calibre 21. Luego pase el cilindro de espuma de gelatina y alinéelo con el collar.

Finalmente, autoclave el pin en un ciclo seco a 120 grados Celsius y 15 PSI. La espuma se secará y oscurecerá de color después de confirmar la sedación por el método apropiado aprobado institucionalmente. Comience el procedimiento quirúrgico colocando un anestesiado con las extremidades traseras hacia arriba sobre un paño estéril.

Aplique ungüento para los ojos al animal y luego, después de quitar el pelaje, cubra al animal con una cortina fenestrada limpia y ubique el cristalino proximal y distal del fémur. Incida la piel de cinco a 10 milímetros a lo largo del eje longitudinal. A continuación, utilice un bisturí número 15 para separar la capa de piel de la fascia, exponiendo un abordaje lateral del fémur a través del bíceps para los MA y el vestus lateralis.

Localiza donde están los tabiques de ambos músculos. Se encuentra con una línea de tejido blanco contra la coloración rosada del músculo donde el bisturí disecciona cuidadosamente a lo largo de este límite intermuscular hasta que el fémur es visible. A continuación, utilice un elevador perióstico romo para desarrollar la incisión de modo que quede al descubierto toda la diáfisis.

A continuación, exponer aún más los dos tercios centrales del fémur, teniendo cuidado de preservar el haz neurovascular posterior en el lado medial. Use un bisturí para raspar suavemente el tejido blando del hueso y luego seque el hueso con un aplicador estéril con punta de algodón. Ahora use una regla estéril o pinzas para ubicar el centro del fémur y marque el hueso a 1,5 milímetros aproximadamente y distalmente del centro.

A continuación, agarre suavemente el fémur con un par de pinzas de nariz fina previamente diseñadas al estilo actual, y utilice un taladro fino equipado con una rueda de corte recubierta de grano de diamante fino para hacer el primer corte con el elevador en su lugar para proteger el tejido. Abajo. Elevar el fémur cortado a 45 grados mientras se sujeta firmemente la extremidad de la diáfisis. Realiza el segundo corte retirando un segmento de tres milímetros con el hueso inmovilizado por pinzas.

Escariar cuidadosamente las cavidades medulares de cada extremo con una aguja hipodérmica roma de calibre 23. Luego, el uso de un medidor de profundidad prefabricado hecho de una longitud de tubo de calibre 22 colocado dentro de un tubo de calibre 19, confirmó que la profundidad de la cavidad es de tres milímetros. Cuando el hueso esté listo, inserte el clavo preparado en las cavidades medulares proximal y luego distal para que el fémur vuelva a su longitud original y para establecer un espacio estable de tres milímetros.

Confirme que el clavo encaja perfectamente en ambas cavidades medulares y que los bordes del hueso cortado están enrasados con el collar. A continuación, vuelva a colocar el músculo y el tejido periférico sobre el clavo y ciérrelo con una sutura continua absorbible de cinco ceros. Cierre la piel con cinco nylon de siete nudos cuadrados, cinco suturas cero y selle la incisión con adhesivos quirúrgicos.

Fueron sacrificados de acuerdo con las pautas de A VMA y también bajo un protocolo aprobado por iacuc. Después de dos a cinco semanas, exponga el fémur proximal y la pelvis desde el lado medial del animal para diseccionar cuidadosamente la extremidad trasera. A continuación, presione suavemente la articulación hacia adentro desde el lado lateral de la extremidad mientras utiliza un bisturí para separar la cabeza femoral del acetábulo.

Use un bisturí afilado para cortar el músculo y la piel restantes, liberando toda la extremidad de la pelvis. A continuación, corte el exceso de tejido y la extremidad trasera inferior aproximadamente cinco milímetros por debajo de la articulación de la rodilla y retire la piel, dejando el músculo en su lugar. A continuación, fije el tejido en formina tamponada al 10% suplementada con fijador de cloruro de calcio de 10 milimolares durante una semana, seguido de almacenamiento y PBS suplementado con cloruro de calcio de 10 milimolares hasta un mes antes de la toma de imágenes.

Para analizar los especímenes, envuelva los pañuelos en una capa delgada de plástico en el techo. Filme y colóquelos verticalmente, uno a la vez. En la cámara de imágenes de micro CT, configure la exploración con los siguientes parámetros.

Voltaje a 29 kilovoltios, corriente a 661 miliamperios, potencia a 19 vatios. Tamaño de píxel de la imagen a 21 micras. Rotación de 360 grados a sí promedio de fotogramas a en rotación, paso a un grado y movimiento aleatorio a encendido.

A medida que se adquiere cada imagen, guárdela como archivos jpeg en una sola carpeta de destino por escaneo. A continuación, utilizando las imágenes axiales y el software analítico de cada archivo, seleccione las secciones que abarcan el collar sólo para establecer los bordes proximales y distales del defecto original, y para definir la región de interés. Por último, dibuje una zona de exclusión con un margen de 100 micras alrededor del collar para excluirla de los cálculos y, a continuación, transfiera la zona a cada una de las secciones de la región de interés.

Sin intervención terapéutica, los bordes del defecto suelen extenderse 0,5 milímetros durante los primeros 21 días después de la cirugía. Después de 14 a 21 días de curación, el volumen del hueso de novo se puede determinar fácilmente a partir de las imágenes axiales generadas por la micro tomografía computarizada. El volumen del nuevo hueso generado aumenta con el tiempo, pero generalmente no supera un total de un milímetro cúbico.

En ausencia de intervención terapéutica después de 21 días, el momento polar de inercia del hueso de novo a 0,25 milímetros de los bordes de la lesión, oscila entre 0,05 a 0,35 milímetros cuarto en comparación con 0,02 a 0,08 milímetros cuarto en el centro de la lesión. Confirmando aún más la presencia de la pseudoartrosis en los casos no tratados, como se muestra en esta imagen representativa, la tricografía TRI de Mason, la tinción de secciones longitudinales descalcificadas permite la visualización del crecimiento óseo endocondral con el borde delantero del cartílago seguido de hueso esponjoso. Si bien es inevitable que ocurran algunos daños durante la disección, si el clavo se retira con cuidado, la estructura histológica del hueso y el tejido conectivo permanecerán limpios.

Alternativamente, la inclusión de metilmetacrilato y el corte de secciones no desmineralizadas se pueden realizar con el dolor en su lugar. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos como CAR, TPCR, Microarray o immuno blot en el tejido recuperado para responder preguntas adicionales como, ¿cómo afectan ciertas células genotipo, proteínas o incluso compuestos a la reparación ósea? En nuestros estudios, utilizamos células humanas y proteínas humanas en ratones inmunocomprometidos.