Name: Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprenda a aislar y cultivar neuronas dopaminérgicas primarias del mesencéfalo ventral de roedores. Este protocolo optimizado facilita el estudio de la neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson mediante microscopía de inmunofluorescencia.

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Este trabajo se realizó utilizando los fondos de la División de Ciencias del Cerebro, Departamento de Medicina, Imperial College London para K.N.A.

NOTA: Los animales fueron mantenidos y manejados de acuerdo con las directrices institucionales y de todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Bienestar Animal del Colegio Imperial y Órgano de Examen de Ética (AWERB) y el Ministerio del Interior y la Universidad de Harvard Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC), de conformidad con los reglamentos federales y estatales. 1. Reactivo y Configuración del equipo <ol><li> Thaw, alícuota y almacenar 1 mg / ml solución laminina a -80 ºC. Disolver 2 l en 1 ml de DMEM / F12, resultando en una concentración de recubrimiento de 1-2 g / cm 2. NOTA: Descongelar Laminin lentamente en hielo y se disuelve en frío DMEM / F12 y de inmediato añadir a los platos / cubreobjetos. </li><li> Diluir 75 ml de 0,01% de poli-L-ornitina en 425 ml de PBS y se almacena a 4 ºC. NOTA: La vida útil de la solución de trabajo es de hasta un mes. </li><li> Disolver 25% (p / v) de BSA en PBS, pH 7,4, y se almacena a 4 ° C durante un máximo de un year. </li><li> Preparar 50% de FBS (en HBSS) medios de desactivación. </li><li> Preparar medio completo mediante la adición de 50 U / ml de penicilina y estreptomicina, 1x suplemento N2, 5% (vol / vol) de FBS, 0,36% D - (+) - glucosa (peso / vol), 0,25% de BSA (peso / vol) a DMEM / F12 y almacenar a 4 ºC. NOTA: La vida útil es de hasta 10 días. </li><li> Coloque los cubreobjetos en ebullición 70% (vol / vol) de etanol durante al menos 30 min para eliminar los restos de grasa y autoclave. </li><li> Coloque los cubreobjetos en placas de 24 pocillos y añadir 500 l solución de poli-L-ornitina a cada pocillo. Incubar 1 hr bajo la campana de cultivo de tejido a TA y después, lavar 3 veces con 500 l de agua. Añadir solución de laminina 500 l a cada placa y se incuba O / N en la incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 ºC. NOTA: Si bien no hay lavados son necesarias después del tratamiento laminina, lavar los poli-L-ornitina menos de tres veces resulta en la muerte de las células 24 h después del cultivo. </li><li> Pulir las puntas de pipetas de vidrio más de gas natural o antorcha fcojo. NOTA: Después de este paso, el diámetro de la punta debe ser aproximadamente la mitad de su tamaño normal. </li><li> Cortar las tapas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga, utilizando una tijera autoclave y autoclave. </li></ol> 2. Disección de Embryonic ventral mesencéfalo <ol><li> Narcotizar oportuna embarazadas (E12.5) presas por inhalación de CO2 y luego practicar la eutanasia por dislocación cervical. </li><li> Pulverizar el abdomen con etanol al 70% y hacer una incisión abdominal hasta los sacos uterinos están expuestos. Utilizando unas pinzas cortan la fijación vaginal y eliminar útero. Coloque el útero en HBSS enfriado en hielo, en un 100 mm placa de Petri. </li><li> Retire embriones del útero y el saco amniótico, utilizando pinzas (Figura 1C). Coloque los embriones en fresco HBSS helada. NOTA: El rectángulo en la Figura 1D indica la ubicación del mesencéfalo ventral embrionario. </li><li> Coloca los embriones bajo un microscopio de disección (10 aumentos) y diseccionar el mesencéfaloarco cortando el cerebro en el istmo y la región frontera mesencefálico-diencefálica, utilizando el bioscissor y pinzas (Figura 1E, por favor refiérase a la Figura 1A para las líneas de incisión). </li><li> Después de sacar todo el cerebro medio, hacer un corte en el mesencéfalo mediodorsal (Figura 1F). </li><li> Eliminar meninges, utilizando dos pinzas (Figura 1H). NOTA: PASO CRÍTICO: Este paso es esencial para el rendimiento óptimo neuronal y la supervivencia. Dado que las condiciones de cultivo son óptimos para las células del cerebro, la mayoría de las células del tejido circundante mueren después de la siembra y la señal apoptótica partir de este tejido puede dañar la integridad de las culturas. </li><li> Acoplar el tejido del cerebro medio en la placa de Petri para observar la forma de mariposa y corte aproximadamente la mitad de cada ala, utilizando una cuchilla de afeitar esterilizada (Figura 1 H, I). NOTA: Figura 1J representa el mesencéfalo ventral aislado. </li><li> Transferir elpieza de mesencéfalo ventral en HBSS enfriado con hielo en un tubo cónico de 15 ml y proceder con el siguiente embrión. NOTA: Los pasos 2.1 a 2.8 no deben tomar más de 1 hora. Mantener los embriones más allá de este marco de tiempo en hielo disminuye significativamente la viabilidad celular. </li></ol> 3. La disociación de las células ventral mesencéfalo <ol><li> La transferencia de los trozos de cerebro medio ventral bajo una campana de flujo laminar. Retire la HBSS y añadir 1 ml precalentado (37 ºC) 0,05% de tripsina-EDTA en el tubo cónico (volúmenes suficientes para un máximo de 12 piezas de mesencéfalo ventral). Incubar el tejido a 37 ºC durante 5-10 minutos. </li><li> Eliminar tripsina-EDTA bajo el capó y se añade medio de la activación de-1 ml (el suero se desactivará tripsina) para el tejido. </li><li> Retire el medio de desactivación y lavar el tejido en 1 ml de medio completo dos veces. NOTA: evitar la eliminación de todo el medio del tubo y pipetear el tejido, para evitar desechar las células disociadas. </li><li> Añadir 1 ml de medio completo y triturato el tejido con una pipeta de vidrio pulida al fuego. Evitar la formación de burbujas y seguir triturando hasta que se logre la suspensión de células individuales. NOTA: Por lo general, 8-10 pasa por la punta restringido son necesarios para la disociación completa. </li><li> Centrifugar las células a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el medio. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de medio completo por lentamente la pipeta hacia arriba y hacia abajo para un máximo de cuatro veces. </li></ol> 4. Las células Chapado ventral mesencéfalo <ol><li> Mezclar 10 l de la suspensión celular con 90 l solución de azul de tripano y contar el número de células con un hemocitómetro. NOTA: La viabilidad de las células también se puede comprobar en esta etapa. </li><li> Coloque tapas de los tubos de microcentrífuga esterilizado en 100 mm placas de Petri y transferir los / laminina cubreobjetos recubiertos de poli-L-ornitina, utilizando fórceps, uno a la vez en la parte superior de las tapas. NOTA: No lave los cubreobjetos y evitar el secado de la laminina, ya que esto puede causar UNEVEculturas n y disminución de la supervivencia de las células. </li><li> Ajustar el volumen a 1500 células por 1 l mediante la adición de medio completo y añadir 100 l (un total de 150.000 células) de la suspensión celular en la parte superior de cada cubreobjetos (el volumen es óptimo para cubrir la superficie del cubreobjetos sin derrames). Cierre las placas de Petri y se incuba durante 1 hr ellos en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado (37 ° C, 5% de CO 2). NOTA: PASO CRITICAL: Este paso es necesario para mejorar la unión y viabilidad de las células y para aumentar el número de cubreobjetos por embrión. Alternativamente, las células se pueden transferir directamente a los pozos (que contienen cubreobjetos), pero el número de células se debe aumentar a 350 mil por pozo (en lugar de 150.000). En otras palabras, utilizando este método, 8-10 cubreobjetos se pueden adquirir, mientras que la transferencia directa produce unos 3-4 cubreobjetos a causa de las células, que se unen a las placas (al lado o debajo de los cubreobjetos). El viabili promedioTy de los cultivos, utilizando este método fue de alrededor de 90%. </li></ol> 5. Crecimiento y Mantenimiento Cultura <ol><li> Después de 1 hora de incubación, transferir cuidadosamente el cubreobjetos incluyendo el medio en placas de 24 pocillos, que contiene 400 l de medio completo precalentado (a 37 ºC) (volumen total: 500 l). Se incuban las células O / N a 37 ºC. </li><li> Dentro de 24 horas después de la incubación de los pocillos, añadir suavemente medio completo 500 l en cada pocillo. NOTA: Las primeras horas es la etapa más crítica para la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas y el número de células supervivientes no cambia significativamente más allá de este punto. </li><li> No agregue soportes adicionales a las culturas de las dos primeras semanas o hasta que el medio se convierte en amarilla. Si el cultivo durante más de dos semanas o cambios de color medio a amarillo, cambio de la mitad de los medios de comunicación (500 l) con frescos completas medios pre-calentado (normalmente cada dos semanas). NOTA: Las neuronas dopaminérgicas dentro de laculturas sobrevivirían durante más de 6 semanas bajo estas condiciones. </li></ol>

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<li>Bjorklund, A., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+systems+in+the+brain%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron systems in the brain: an update.</a> Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).</li>
<li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39, 889-909 (2003).</li>
<li>Dexter, D. T., Jenner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+disease%3A+from+pathology+to+molecular+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms.</a> Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).</li>
<li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aetiopathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurology%22%5BJournal%5D)">Aetiopathogenesis of Parkinson's disease.</a> J Neurology. 258, S307-S310 (2011).</li>
<li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+gene+expression+of+midbrain+dopaminergic+neurons+reveals+molecules+involved+in+their+vulnerability+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection.</a> Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).</li>
</ol>

No se declara ningún conflicto de intereses.

Las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo son la principal fuente de dopamina en el sistema nervioso central. Se dividen en tres grupos, sustancia negra pars compacta (SNpc), el área ventral tegmental (VTA) y el campo retrorubral (FRR) 10, 11. Las neuronas SNpc VTA y dan lugar a importantes vías dopaminérgicas, mesocorticales, mesolímbico y nigro-estriado, que participan en funciones como el control de las emociones, la motivación y el comportamiento motor. Desaparición de las neuronas en SNpc y alteració...

La pérdida de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta conduce a los síntomas motores cardinal de la enfermedad de Parkinson (PD), el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente. La causa subyacente de la desaparición de esta población neuronal mesencephalic no se conoce. Para el estudio de las vías bioquímicas responsables del desarrollo y la modulación de las propiedades neurofisiológicas y la supervivencia de las neuronas Mesda, varios de cultivo de células y sistemas de modelos animales se han utilizado. Las líneas celulares inmortalizadas, incluyendo la línea celular de rata dopaminérgica 1RB 3 AN 27 (N27), el dopaminérgica línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, la línea celular híbrida de ratón dopaminérgica MN9D y mesencefálico humana LUHMES células se han utilizado para estudios mecanísticos bioquímicos y limitadas 1 -5. Para el estudio de la pérdida específica de neuronas Mesda, varios neurotoxina y basados ​​en modelos genéticos se han desarrollado 6-8. Culturas mesencéfalo ventral primaria, Proporcionar una herramienta indispensable para el estudio de las propiedades neuronales y sinápticas de las neuronas dopaminérgicas y las vías implicadas en la patogénesis de esta enfermedad común. Aquí presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas, que contiene modificaciones resultantes en una mayor capacidad de supervivencia y el aumento de rendimiento de cubreobjetos por embrión. El uso del mesencéfalo E12.5 ratón prematuro (E14.5 en rata) mejora la supervivencia. A esta edad las neuronas no se han desarrollado todavía los axones, lo que deja las células intactas durante la disección y minimiza el estrés aumentando así significativamente la viabilidad. Además, la disección cuidadosa del mesencéfalo ventral, como se describe en la sección 2 de este protocolo, mejora aún más la capacidad de supervivencia. Para aumentar el número de cubreobjetos por embrión, una técnica de siembra alternativa se presenta en la sección 4 de este protocolo. Esto conduce a un rendimiento de hasta 10 cubreobjetos por embrión en comparación con 4 cubreobjetos bajocondiciones de chapado estándar reduciendo así la cantidad de animales por experimento. Las neuronas en la cultura de exposiciones consecuencia de los axones y dendritas, forman conexiones sinápticas y revelan la presencia de marcadores neuronales y sinápticas que hacen estas culturas adecuado para imágenes de células vivas, inmunocitoquímica y estudios electrofisiológicos. Además, el uso de cultivos neuronales facilita la manipulación genética y farmacológica. Excrecencia de neuritas a partir del día 2 in vitro permite estudios de desarrollo. Por otra parte, la supervivencia a largo plazo de las culturas (hasta seis semanas) hace que sean adecuadas para el estudio de la degeneración progresiva y lenta de estas neuronas.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Mezcla de nutrientes medio Eagle modificada F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS) (1X), líquida</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, inactivado por calor (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplemento (100X), líquido</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa solución (45% (peso/vol) en agua</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina BSA</td><td>Sigma</td><td>A9430</td><td></td></tr><tr><td>de Engelbreth-Holm-Swarm membrana basal para sarcoma murino</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0,05% (peso/vol)</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino cultivo celular de albúmina (BSA) probado</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa (Th)</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P60101-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina, solución al 0,01%</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Map2 (proteína-2A y -2B asociada a microtúbulos)</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>anti-Sinapsina-1</td><td>Millipore AB1543P</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-conejo IgG&nbsp; &nbsp; anticuerpo</td><td>Sondas moleculares</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 burro anti-conejo IgG&nbsp; &nbsp; anticuerpo</td><td>Sondas moleculares</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-ovejas IgG&nbsp; &nbsp; anticuerpo</td><td>Sondas moleculares</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 burro anti-ovejas IgG&nbsp; &nbsp; anticuerpo</td><td>Sondas moleculares</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 burro anti-ratón IgG&nbsp; &nbsp; anticuerpo</td><td>Sondas moleculares</td><td>A-21203</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano (0,4% (peso/vol))</td><td>Biowhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase invertida</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 40 C</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>May-45</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas deslizantes &ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11251-33</td><td></td></tr><tr><td>Dos pinzas Dumont #45 &ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11245-30</td><td></td></tr><tr><td>Portacuchillas/Rompedor Empuñadura Plana - 11cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de Iris para Estudiantes - Rectas 11,5 cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador halógeno de fibra óptica</td><td>Nikon</td><td>MKII</td><td></td></tr><tr><td>Desechable Vidrio de borosilicato Pasteur Pipetas Fisherbrand</td><td></td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Proscitech</td><td>SVZ2NIOU</td><td></td></tr><tr><td>0.2 y micro; m unidades de filtro estéril</td><td>Nalgene</td><td>NL-CE-156-4020</td><td></td></tr><tr><td>100x20 mm Placas de Petri</td><td>BD Biosciences</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondos #1 Espesor Vidrio alemán 12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-10012&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

La degeneración de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas (mesDA) es el sello patológico de la enfermedad de Parkinson. El estudio de los procesos biológicos implicados en las funciones fisiológicas y en la vulnerabilidad y muerte de estas neuronas es fundamental para comprender las causas subyacentes y desentrañar la cura de este trastorno neurodegenerativo común. Los cultivos primarios de neuronas mesDA proporcionan una herramienta para la investigación de las propiedades moleculares, bioquímicas y electrofisiológicas, con el fin de comprender el desarrollo, la supervivencia a largo plazo y la degeneración de estas neuronas durante el curso de la enfermedad. Aquí presentamos un método detallado para el aislamiento, cultivo y mantenimiento de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de embriones de ratón E12.5 (o rata E14.5). Las condiciones optimizadas de cultivo celular en este protocolo dan como resultado la presencia de proyecciones axonales y dendríticas, conexiones sinápticas y otras propiedades morfológicas neuronales, lo que hace que los cultivos sean adecuados para el estudio de las características fisiológicas, biológicas y moleculares de esta población neuronal.

La inmunohistoquímica contra la tirosina hidroxilasa (TH) muestra que entre 0,5-1% de las células en cultivo son dopaminérgica. Proyecciones neuronales aparecen dentro de 2 horas después de la siembra y antes del primer día, los axones y dendritas son distinguibles (Figura 2), utilizando proteína 2 (Map2) anticuerpos asociada a los microtúbulos (Figura 3) tirosina hidroxilasa (TH) y. Las neuronas a sobrevivir durante más de seis semanas y muestran una amplia extensión. La relación neuro...

Las causas de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo durante la enfermedad de Parkinson no se comprenden completamente. Los sistemas de cultivo celular proporcionan una herramienta esencial para el estudio de las propiedades neurofisiológicas de estas neuronas. Aquí presentamos un protocolo optimizado, que se puede utilizar para el modelado in vitro de la neurodegeneración.

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

El objetivo de este procedimiento es aislar y cultivar de manera eficiente neuronas primarias del mesencéfalo ventral de roedores. Esto se logra primero mediante la disección del mesencéfalo de embriones de roedores. El segundo paso consiste en aislar cuidadosamente el mesencéfalo ventral.A continuación, el tejido neuronal debe disociarse para obtener una suspensión de células individuales. El paso final consiste en sembrar los neuronas primarios en un pequeño volumen sobre cubreobjetos antes de transferir las células adheridas a una placa de 24 pocillos más adelante. Finalmente, se utiliza un anticuerpo y microscopía de inmunofluorescencia para identificar las neuronas dopaminérgicas dentro del cultivo.Las neuronas dopaminérgicas en el cerebro medio participan en diversas funciones, incluido el control del movimiento y la emoción en la cognición, así como en el sistema de recompensa del cerebro. También están implicadas en trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos, como la enfermedad de Parkinson, la adicción y la esquizofrenia. El método de reparación del cerebro medio ventral.Los cultivos neuronales pueden utilizarse para estudiar la fisiología y las propiedades celulares de las neuronas dopaminérgicas, así como para comprender la causa de su degeneración durante trastornos como la enfermedad de Parkinson. Primero, prepare las laminillas.Hervirlos en etanol al 70 % durante al menos 30 minutos para eliminar cualquier rastro de grasa. Luego, autoclavar las laminillas. Transferir las laminillas a placas de 24 pocillos y añadir medio mililitro de poliol de alteno a cada uno.Bien, deje que las placas se incuben durante una hora a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que la vida útil de la solución de poliol o de Athene en uso es de un mes. Luego, lave las laminillas tres veces con medio mililitro de agua por lavado.Sin los tres lavados, las células cultivadas no sobrevivirían 24 horas. A continuación, repare la solución de laminina. Asegúrese de descongelarla lentamente sobre hielo.Luego, disuelva la laminina en D-M-E-M-F 12 frío y utilícela inmediatamente. Añada ahora medio mililitro de la solución de trabajo de laminina recién preparada a cada pocillo y deje que las placas incuben durante la noche a 37 grados Celsius. Por último, al preparar la pipeta de vidrio, pulo sus puntas hasta reducirlas a la mitad de su tamaño normal.Realice una incisión abdominal para exponer los sacos uterinos y, utilizando fórceps, corte y libere el útero. Transfiera el útero a HBSS frío con hielo en una placa de 100 milímetros y comience a retirar los embriones con fórceps. Transfiera los embriones aislados a una nueva placa con HBSS frío.Ahora, bajo un microscopio de disección, prepárese para acceder a esta ubicación del mesencéfalo ventral con un aumento de 10x. Diseque el mesencéfalo y el arco cefálico cortando el cerebro en la región del istmo y en el límite mesencéfalo-diencefálico utilizando tijeras quirúrgicas o pinzas. Después de extraer todo el mesencéfalo, realice un corte en la región media dorsal del mesencéfalo.Utilizando fórceps, retire las meninges. Este paso es fundamental para el éxito del cultivo neuronal. Las células no neuronales morirán en las condiciones de cultivo y señalarán adversamente a las neuronas vecinas.Ahora aplane el tejido del mesencéfalo en forma de mariposa. Corte aproximadamente la mitad de cada ala con una hoja estéril, dejando el mesencéfalo ventral. Transfiera el mesencéfalo ventral al HBSS frío con hielo en un tubo cónico de 15 mililitros.Luego, proceda a diseccionar el siguiente embrión, procesando tantos embriones como sea posible dentro de una hora. Los embriones mantenidos en hielo durante más de una hora tienen baja viabilidad celular. Para asegurar una alta viabilidad de las neuronas dopaminérgicas, el tiempo desde la disección hasta la siembra no debe exceder una hora.Además, la eliminación de las meninges es crucial para la supervivencia de las neuronas bajo una campana extractora. Retire el HBSS del conjunto del mesencéfalo ventral. A continuación, agregue un mililitro de tripsina al 0,05 % en A DTA, suficiente solución para 12 fragmentos de tejido.Incube el tejido a 37 grados Celsius durante cinco a 10 minutos. Bajo la campana, reemplace la tripsina A DTA con un mililitro de medio de desactivación. Agite suavemente para mezclar, y luego retire el medio de desactivación, pero deje suficiente medio para que las células disociadas no se descarten.A continuación, lave los tejidos dos veces con medio completo sin perder las células. Ahora agregue un mililitro de medio completo. Luego, triture el tejido con la pipeta de fuego pulido sin formar burbujas hasta obtener una suspensión de células individuales.Aproximadamente ocho a diez pasajes deberían ser suficientes. Transcurrido este tiempo, centrifugar las células a 400 Gs durante cinco minutos. Eliminar el medio y resuspender las células en un mililitro de medio completo.Pipetee las células hasta cuatro veces para obtener una suspensión. Comience contando y evaluando la salud de las células en la suspensión. Utilice la exclusión con azul de tripano con un hemocitómetro.Ahora ajuste la suspensión celular a 1500 células por microlitro. Luego transfiera las tapas de los tubos microcentrífugos esterilizadas a placas de 100 milímetros. Coloque los cubreobjetos preparados sobre las tapas utilizando pinzas.No lave las laminillas y trate de evitar que se sequen. Aplique 100 microlitros de suspensión sobre cada laminilla. Este método algo inusual proporciona una viabilidad del 90 % de la cultura y es un paso crítico para el éxito.Luego, cierre la placa de Petri y transfiérala al incubador durante una hora; después de la incubación, transfiera cuidadosamente las laminillas con el medio a placas de 24 pocillos que contengan 400 microlitros de medio completo precalentado a 37 grados Celsius en cada pocillo, y luego incube las células durante la noche. Las primeras horas son las más críticas para la supervivencia celular dentro de las 24 horas. Añada suavemente medio completo medio mililitro a cada pocillo.Cada dos semanas. Cambie la mitad del medio. Si el cultivo se vuelve amarillo, entonces se puede realizar el cambio de la mitad del medio antes, pero el cambio aún debe ser infrecuente.Las neuronas dopaminérgicas sobrevivirán más de seis semanas bajo estas condiciones. Después de dos semanas de cultivo, la inmunohistoquímica frente a tirosina, hidroxilasa y marcadores neuronales muestra que el 1% de las células son dopaminérgicas. Las proyecciones neuronales aparecen dentro de las dos horas posteriores a la siembra.Al final del primer día en cultivo, se pueden distinguir axones y dendritas. En última instancia, las neuronas sobreviven más de seis semanas y muestran un crecimiento extenso tras seguir este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como la transducción viral, la inmunofluorescencia o la electrofisiología para responder preguntas mecanicistas en neuronas dopaminérgicas.

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Primaria disociada del cerebro medio de cultivos celulares permiten la dopamina para el estudio de las características pre-sináptica de las neuronas dopaminérgicas. Pueden ser utilizados para monitorear en tiempo real la cinética de la liberación de dopamina y de la proteína / niveles de ARNm de los reguladores de la exocitosis de dopamina. Aquí te mostramos cómo generar estas culturas de los recién nacidos de roedores.

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Una forma alternativa de aislar a las neuronas motoras de embriones de ratón de la médula espinal se describe. El método tiene en cuenta el hecho de que las lectinas pueden unirse a los nervios de baja afinidad p75NTR receptor del factor de crecimiento. Esta lectina preplating basado permite una purificación similar a la que con un anticuerpo específico contra el p75NTR.

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Proporcionamos un protocolo para el cultivo de las neuronas del hipocampo altamente purificada de cerebros de ratones prenatales sin el uso de una capa alimentadora de células gliales.

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

Se describe un método rápido para aislar y cultivar las neuronas del hipocampo y la corteza a partir de embriones de roedores. Este protocolo nos permite realizar experimentos en los que los cultivos neuronales casi puros son necesarios.

Aislamiento y cultivo de células neuronales de ratas embrionarias: un protocolo rápido

Este video describe un método para cultivar neuronas dopaminérgicas a partir de tejido cerebral embrionario de ratón. El proceso incluye el tratamiento del mesencéfalo con una enzima proteolítica, la separación de las células y el cultivo de las mismas en cubreobjetos recubiertos de polímeros en un medio rico en nutrientes con antibióticos para su crecimiento y viabilidad a largo plazo.

Cultivo y mantenimiento de neuronas dopaminérgicas a partir de tejido cerebral embrionario de ratón

El video muestra el aislamiento de neuronas oculomotoras, trocleares y motoras espinales de un embrión de ratón transgénico. El embrión expresa neuronas motoras marcadas con una proteína verde fluorescente (GFP) para una fácil visualización e identificación. Las neuronas motoras se aíslan quirúrgicamente bajo un microscopio de fluorescencia y se mantienen en un medio de cultivo.

Aislamiento y cultivo de neuronas motoras oculomotoras, trocleares y espinales de un embrión de ratón

El video muestra el proceso de aislamiento y cultivo de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de embriones de ratón. Los pisos ventrales aislados del mesencéfalo se disocian mediante enzimas. Las neuronas dopaminérgicas resultantes se recolectan y se transfieren a microislas dentro de placas de pocillos múltiples. Las células se incuban con un medio neuronal dopaminérgico para mantener las células a una alta densidad dentro de las microislas.

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Las neuronas dopaminérgicas desempeñan un papel regulador vital en el cerebro. Su pérdida se asocia con la enfermedad de Parkinson. En este vídeo, mostramos cómo generar cultivos primarios de neuronas dopaminérgicas centrales a partir de mesencéfalo de ratón embrionario. Tales cultivos son útiles para estudiar la extrema vulnerabilidad de estas neuronas a diversos estreses.

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Este trabajo presenta un protocolo para producir cultivos celulares homogéneos de neuronas motoras primarias oculomotoras, trocleas y espinales. Estos cultivos se pueden utilizar para análisis comparativos de las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras oculares y espinales.

Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Islmnprenatal :GFP Ratones transgénicos

Un stock congelado de neuronas listo para usar es una herramienta poderosa para evaluar las funciones sinápticas. Aquí, introducimos un cultivo primario fácil de baja densidad a partir de material congelado utilizando una placa de 96 pocillos.

Cultivo primario de baja densidad fácil y reproducible utilizando existencias congeladas de neuronas embrionarias del hipocampo

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Aprenda a aislar y cultivar neuronas dopaminérgicas primarias del mesencéfalo ventral de roedores. Este protocolo optimizado facilita el estudio de la neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores (Video) | JoVE Journal

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

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