דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור שתלי כלי דם מהונדסים רקמות הפונקציונליים להשתלה בעכברים. זה מושג על ידי תכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים חלקית במבחנה, המסוגלים להתמיין לתאי אנדותל ושריר חלק. לאחר מכן מסירים אבי העורקים מעכבר שהוקרב ועוברים דה-סלולריזציה עם נתרן דודה סולפט או תמיסת SDS להכנת שתלי אבי העורקים הנטולי תאים.

לאחר מכן, מעגל הזרימה של הביוריאקטור מוגדר לזריעה כפולה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים חלקית. השלב האחרון הוא השתלת השתלת תאי גזע פלוריפוטנטיים כפולים בעכברים. בסופו של דבר, ניתוח שיעורי תמותת העכברים שלושה שבועות לאחר ההשתלה משמש כדי להראות את הפונקציונליות של שתלי כלי הדם המהונדסים ברקמות.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות לב וכלי דם מכיוון שהוכח שהיא מייצרת בהצלחה כלי דם פונקציונליים באמצעות תאי PIPS בפרק זמן קצר. באופן כללי, חשוב מאוד לשמור על שתל כלי הדם שלם וסטרילי במהלך כל ההליך, במיוחד עבור אנשים חדשים בשיטה זו. התחל הליך זה עם תכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים חלקית או תאי PIPS על ידי העברת התאים עם ארבעה מיקרוגרם של פלסמיד OSKM ליניארי באמצעות ערכת חיבה גרעינית של פיברובלסטים עוריים אנושיים.

פיברובלסטים אנושיים הופכים לתאי PIPS לאחר ארבעה ימים של תכנות מחדש. בעקבות הקרבת עכבר על ידי פריקת צוואר הרחם. מערבבים את העכבר במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

לאחר מכן חותכים את עצם החזה וסביב כלוב הצלעות כדי לפתוח את חלל בית החזה. הסר את הלב, הריאות והוושט כדי לחשוף את אבי העורקים, ולאחר מכן הסר בעדינות את השומן פרי אבי העורקים בעזרת מלקחיים. חותכים את אבי העורקים מהקצה הקדמי בעזרת מספריים ומחזיקים בעדינות את הקצה בעזרת מלקחיים קהים.

לאחר מכן נתק את אבי העורקים מעמוד השדרה מאחור על ידי דיסקציה קהה. סגור בזהירות את כל העורקים המסתעפים מאבי העורקים על ידי קשירה בעזרת קרישה אלקטרו דו קוטבית וחיתוך מקצה הקשירה במספריים. השתמש במזרק של חמישה מיליליטר כדי לשטוף את לומן אבי העורקים בשלושה מיליליטר תמיסת מלח המכילה 100 יחידות הפרין.

כדי למנוע היווצרות קרישי דם, חותכים את הקצה האחורי של אבי העורקים לפני שהוא מסתעף לכליות. שמירה על שלמות אבי העורקים חשובה מאוד במהלך כל ההליך. לאחר מכן, שופע את לומן אבי העורקים בחמישה מיליליטר של 0.075.

נתרן דול סולפט או תמיסת SDS מדוללת במי מלח בופר פוספט או PBS משרים את אבי העורקים הרזאי בתמיסת SDS של 0.075% בצלחת פטרו של 10 סנטימטר על שייקר אורביטלי למשך שעתיים ב-150 סל"ד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מברישים את לומן אבי העורקים בחמישה מיליליטר PBS. לאחר מכן, יש להשרות את אבי העורקים ב-PBS בצלחת פטרו של 10 סנטימטר ולהניח את צלחת הפטרו על השייקר המסלולי ב-150 סל"ד למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.

רענון ה-PBS כל 20 דקות לאחר שעתיים. הסמיק את לומן אבי העורקים עם חמישה מיליליטר PBS. כדי להתחיל, הרכיבו את מעגל הזרימה של הביוריאקטור כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, שפץ את הכלי הנטול תאים עם מדיום תרבית על ידי השריית אבי העורקים באמצעי התמיינות בצלחת פטרי של 10 סנטימטר על שייקר המסלול למשך שעה ב-50 סל"ד בטמפרטורת החדר. הכנס צינורות ניילון באורך סנטימטר אחד לשני קצוות הכלי הנטול תאים מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן קושרים את הכלי ואת הצינורות בשמונה תפרי משי אפס.

הרכיבו את שתל אבי העורקים המפורק בתא הדגירה על ידי חיבור צינורות הניילון עם יציאות הכניסה והיציאה מקיר החדר. שמור על תא הדגירה עם חמישה מיליליטר בינוני בכל פעם. לאחר מכן, טריפסין מסתכל על תאי PIPS על ידי הוספת טריפ טרום חם לתוכם.

מכסים את צלחת התרבות ומנדנדים בעדינות את המנה 10 פעמים. השליכו את הטיולים פנימה והשאירו את המנה בחממה למשך שתיים-שלוש דקות. לאחר מכן מוסיפים מדיום תרבית חם מראש בכלי ומערבבים את המדיום עם התאים.

לאחר מכן, ספרו את מספר התא באמצעות צנטריפוגה ציטומטרית המו. שתי קבוצות של תרחיפי תאים המכילים חצי מיליון תאים כל אחד למשך חמש דקות ב -300 פעמים G.לאחר ההפסקה יש להשעות לחלוטין כדור אחד של כדורי התא PIPS. ב -50 מיקרוליטר של dm, הזרקו את תרחיף התאים לתוך לומן הכלי המנותק.

לאחר מכן יש להחיות את כדור התא השני של PIPS ב-100 מיקרוליטר של מטריג'ל. פיפטה בזהירות את התערובת על שתל אבי העורקים המנותק. המתן 10 עד 15 דקות עד שהתערובת הופכת למצב דמוי ג'ל ועוטפת באופן שווה את פני השטח החיצוניים של הכלי.

בשלב זה, בנה את תא הדגירה עם dm. הנח את כל הגדרת הביוריאקטור בחממת פחמן דו חמצני של 5% ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הנח את הצינור המחובר בין מאגר המדיה לתא התאימות על המשאבה הפריסטלטית.

בחממה. סובב ידנית את השתל הנטול 90 מעלות סביב ציר האורך כל חצי שעה בשעתיים הראשונות לאחר שמירה על התרבית סטטית למשך 12 שעות כדי לאפשר לתא להעביר DM דרך הלומן על ידי המשאבה הפריסטלטית כדי לגרום להתמיינות תאי שריר חלק. התחל את קצב הזרימה הראשוני בחמישה מיליליטר לדקה.

לאחר מכן החל עלייה מדורגת של 20 מיליליטר לדקה במשך 24 שעות לאחר שמירה על קצב הזרימה הבינונית במחזור על 20 מיליליטר לדקה למשך 24 שעות, עצור את הזרימה הבינונית והעבר את הגדרת הביוריאקטור אל מחוץ לחממה. לאחר מכן, קנה את לומן השתל עם תאי PIPS על ידי ספירת טריפסין וצנטריף באמצעות מיליון תאי PIPS. כמו קודם, השעו מחדש את התאים ב -50 מיקרוליטר של מצע גידול אנדותל.

שניים מכילים 50 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה אנדותל כלי דם. לאחר מכן הזרקו את תערובת התאים ללומן השתל. שנה את המדיום בתא הדגירה ובמחזור הדם כולו ל-e GM 2 המכיל VEGF כדי לגרום להתמיינות אנדותל.

לאחר הזזת הביוריאקטור בחזרה לאינקובטור, סובב ידנית את השתל 90 מעלות כל חצי שעה בשעתיים הראשונות, ולאחר מכן שמור על תרבית סטטית למשך 12 שעות. לאחר 12 שעות, התחל את הזרימה במחזור מחמישה מיליליטר לדקה עם עלייה הדרגתית ל-35 מיליליטר לדקה, ולאחר מכן שמור על קצב הזרימה על 35 מיליליטר לדקה למשך חמישה ימים. ואז כמובן שתל מהונדס על ידי חיתוך קצות צינורות הניילון.

בסס את השתל על צלחת פטרי המכילה שני מדיה טרייה של GM כהכנה להשתלה לעכבר לאחר הרדמה של העכבר המקבל. תקן את העכבר במצב שכיבה כשצווארו מגולח ומורחב. הכן חתך בקו האמצע מהלסת התחתונה לעצם החזה של העכבר תחת מיקרוסקופ מנתח עם הגברה של פי חמישה עד פי 10.

הרם את בלוטות הסאלי הימניות לרוחב והסר את שריר המסטואיד הימני כדי לחשוף את עורק הצוואר המשותף הימני, הסר בעדינות את הרקמות המחוברות כדי לגייס את עורק הצוואר המשותף הימני מהקצה הדיסטלי לכיוון הקצה הפרוקסימלי. קשר את החלק האמצעי של עורק הצוואר המשותף פעמיים עם תפר משי שמונה אפס ונתח בין שני הצמיגים. עוברים דרך שרוול עשוי צינור ניילון הניתן לחיטוי בכל כלי.

סיים ותקן כל קצה בעזרת מהדקי מיקרו המוסטט. לאחר מכן הסר קשרי תפרים בקצה אחד והחל טיפת הפרין מיד לאחר מכן. הפוך את הקצה הדיסטלי של העורק כדי לכסות את כל גוף השרוול וקבע את הכלי ההפוך עם תפר משי שמונה אפס לשרוול.

לאחר חזרה על אותו הליך לחלק השני של העורק, יש לשטוף את העורק בתמיסת מלח להסרת קרישי דם. לאחר מכן, השתל שתל כלי דם נטול תאים בין שני קצוות עורק הצוואר על ידי החלקת קצות הכלי המנותק מעל שרוול העורק וקיבועו בשמונה תפרי משי אפס. הסר את מהדקי כלי הדם משני הקצוות לפני הערכת פעימת השתל, ולאחר מכן שרוך את בלוטת הסיב הימנית בחזרה למקומה המקורי.

סגור את העור במקום הניתוח עם תפר קטוע באמצעות תפר שש אפס פרולקטין. המשך בטיפול לאחר הניתוח כמתואר בנציג פרוטוקול הטקסט. מורפולוגיה של פיברובלסטים אנושיים לאחר ארבעה ימים של תכנות מחדש לתאי PIPS מוצגת כאן.

תאי PIPS הציגו פנוטיפ מובהק באופן ניכר בהשוואה לפיברובלסטים. כצפוי, כל הפירוק של אבי העורקים הושג על ידי טיפול ב-SDS במשך שעתיים. כתוצאה מכך, אבי העורקים הנטול תאים הופיע כפיגום א-תאי שקוף בהשוואה לאבי העורקים הטרי שנקטף.

בעקבות הזריעה הכפולה של תאי PIPS בתוך אבי העורקים הנטול תאים, שתלי כלי הדם המהונדסים מציגים תכונות אנדותל ותאי שריר חלק בניגוד להשתלות כלי דם נטולות תאים. זה מוצג כאן דרך הכתם הירוק לתאי האנדותל והכתם האדום לתאי שריר חלק. עכברים שהושתלו בהשתלות כלי דם של PIPS הראו שיעור הישרדות של 60% שלושה שבועות לאחר ההשתלה כצפוי.

עכברים שהושתלו בכלי דם נטולי תאים הציגו שיעורי תמותה גבוהים יותר באופן ניכר כבר ביום הראשון לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הקרדיולוגיה לחקור את השימוש בתאי PIPS ושתלי כלי דם דה-סלולריים ביצירת צינורות כלי דם מהונדסים רקמות פונקציונליות. לאחר צפייה בסרטון זה, אני מקווה שתוכלו לקבל הבנה טובה כיצד להכין את שתל כלי הדם הנטול תאים, כיצד להרכיב את הביוריאקטור וכיצד להשתיל את השתל הנסוג בחזרה לעכברים.