Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

Bu prosedürün genel amacı, farelere aşılama için işlevsel olan doku mühendisliği yapılmış damar greftleri oluşturmaktır. Bu, ilk olarak insan fibroblastlarının, endotel ve düz kas hücrelerine farklılaşabilen in vitro olarak kısmen indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra kurban edilen bir fareden bir aort çıkarılır ve hücresi giderilmiş aort greftlerini hazırlamak için sodyum doda sülfat veya SDS çözeltisi ile hücrelerden arındırılır.

Daha sonra, biyoreaktör akış devresi, kısmen indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin ikili tohumlanması için kurulur. Son adım, çift tohumlu, kısmen indüklenmiş pluripotent kök hücre greftinin farelere aşılanmasıdır. Sonuç olarak, greftlemeden üç hafta sonra fare ölüm oranlarının analizi, doku mühendisliği yapılmış damar greftlerinin işlevselliğini göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin etkileri, kardiyovasküler hastalıkların tedavisine kadar uzanır, çünkü kısa bir süre içinde PIPS hücrelerini kullanarak fonksiyonel kan damarlarını başarılı bir şekilde oluşturduğu gösterilmiştir. Genel olarak, özellikle bu yönteme yeni başlayan kişiler için, tüm prosedür boyunca damar greftini sağlam ve steril tutmak çok önemlidir. Bu prosedüre, insan fibroblastlarının kısmen indüklenmiş pluripotent kök hücrelere veya PIPS hücrelerine yeniden programlanmasıyla başlayın, hücreleri bir insan dermal fibroblast nükleer sevgi kiti kullanarak dört mikrogram doğrusallaştırılmış OSKM plazmidi ile keserek.

İnsan fibroblastları, dört günlük yeniden programlamadan sonra PIPS hücreleri haline gelir. Servikal çıkık ile fare kurban edilmesini takiben. Fareyi diseksiyon mikroskobu altında sırtüstü pozisyonda karıştırın.

Daha sonra göğüs boşluğunu açmak için sternumu ve göğüs kafesinin çevresini kesin. Aortu ortaya çıkarmak için kalbi, akciğerleri ve yemek borusunu çıkarın ve ardından peri aort yağını forseps ile nazikçe çıkarın. Aortu ön uçtan makasla kesin ve ucunu künt forseps ile nazikçe tutun.

Daha sonra künt diseksiyon ile aortu arkadaki omurgadan ayırın. Aorttan gelen tüm dallanan arterleri bipolar elektro koagülatör ile ligasyon yaparak ve ligasyonun ucundan makasla keserek dikkatlice kapatın. Aort lümenini 100 ünite heparin içeren üç mililitre salin solüsyonu ile yıkamak için beş mililitrelik bir şırınga kullanın.

Kan pıhtılarının oluşumunu önlemek için, aortun arka ucunu böbreğe dallanmadan önce kesin. Aortun bütünlüğünün korunması tüm prosedür boyunca çok önemlidir. Ardından, aort lümenini beş mililitre 0.075 ile doldurun.

Fosfat tampon salin veya PBS içinde seyreltilmiş sodyum dool sülfat veya SDS çözeltisi, rasik aortu %0.075 SDS çözeltisi içinde 10 santimetrelik bir petro tabakta bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 150 RPM'de iki saat bekletin. Ardından aort lümenini beş mililitre PBS ile fırçalayın. Daha sonra, aortu PBS'de 10 santimetrelik bir petro kabına batırın ve petro kabını oda sıcaklığında iki saat boyunca 150 RPM'de orbital çalkalayıcıya yerleştirin.

PBS'yi iki saat sonra her 20 dakikada bir yenilemek. Aort lümenini beş mililitre PBS ile kızartın. Başlamak için, biyoreaktör akış devresini metin protokolünde açıklandığı gibi monte edin.

Daha sonra, aortu oda sıcaklığında 50 RPM'de bir saat boyunca orbital çalkalayıcı üzerinde 10 santimetrelik bir Petri kabında farklılaşma ortamına batırarak hücrelerden arındırılmış damarı kültür ortamı ile yeniden koşullandırın. Mikroskop altında hücreden arındırılmış kabın her iki ucuna bir santimetre uzunluğunda naylon tüpler yerleştirin. Daha sonra damarı ve tüpleri sekiz adet sıfır ipek dikişle bağlayın.

Naylon tüpleri oda duvarından giriş ve görünüm portlarına bağlayarak hücrelerden arındırılmış aort greftini inkübasyon odasına monte edin. Kuluçka odasını her seferinde beş mililitre orta ile koruyun. Daha sonra, tripsin, içine ön ısıtma gezileri ekleyerek PIPS hücrelerini gözler.

Kültür tabağını örtün ve tabağı 10 kez hafifçe sallayın. Gezileri atın ve tabağı iki ila üç dakika kuluçka makinesinde bırakın. Daha sonra tabağa önceden ısıtılmış kültür ortamını ekleyin ve ortamı hücrelerle karıştırın.

Ardından, bir hemo sitometre santrifüjü kullanarak hücre numarasını sayın. Her biri yarım milyon hücre içeren iki hücre alikutu, 300 kez G'de beş dakika boyunca, supinattan sonra, PIPS hücre peletlerinin bir peletini tamamen yeniden süspanse eder. 50 mikrolitre dm'de, hücre süspansiyonunu hücreden arındırılmış damar lümenine enjekte edin.

Daha sonra diğer PIPS hücre peletini 100 mikrolitre matrigel içinde tekrar askıya alın. Karışımı hücrelerden arındırılmış aort grefti üzerine dikkatlice pipetleyin. Karışım jel benzeri bir duruma dönene ve kabın dış yüzeyine eşit şekilde sarılana kadar 10 ila 15 dakika bekleyin.

Bu noktada, inkübasyon odasını dm ile inşa edin. Tüm biyoreaktör ayarını 37 santigrat derecede %5'lik bir karbondioksit inkübatöre yerleştirin. Ardından, medya haznesi ile uyumluluk odası arasına bağlı boruyu peristaltik pompaya yerleştirin.

Kuluçka makinesinde. Hücre aianın düz kas hücresi farklılaşmasını indüklemek için peristaltik pompa tarafından lümenden DM iletmesini sağlamak için, kültürü 12 saat boyunca statik tuttuktan sonra ilk iki saatte bir hücreden arındırılmış grefti uzunlamasına eksen etrafında 90 derece manuel olarak döndürün. İlk akış hızını dakikada beş mililitre olarak başlatın.

Ardından, dolaşımdaki ortam akış hızını 24 saat boyunca dakikada 20 mililitrede tuttuktan sonra 24 saat boyunca dakikada 20 mililitrelik kademeli bir artış uygulayın, ortam akışını durdurun ve biyoreaktör ayarını inkübatörden dışarı çıkarın. Daha sonra, 1 milyon PIPS hücresi kullanarak tripsin sayımı ve santrifüj ile greftin lümenini PIPS hücreleri ile yeniden dedeleyin. Daha önce olduğu gibi, hücreleri 50 mikrolitre endotelyal büyüme ortamında yeniden askıya alın.

Mililitre başına 50 nanogram vasküler endotelyal büyüme faktörü içeren iki. Daha sonra hücre karışımını greftin lümenine enjekte edin. Endotelyal farklılaşmayı indüklemek için inkübasyon odasındaki ortamı ve tüm dolaşımı VEGF içeren e GM iki olarak değiştirin.

Biyoreaktör ayarını inkübatöre geri taşıdıktan sonra, grefti ilk iki saatte bir her yarım saatte bir manuel olarak 90 derece döndürün ve ardından 12 saat boyunca statik bir kültür tutun. 12 saat sonra, dakikada beş mililitreden kademeli olarak dakikada 35 mililitreye çıkarak dolaşıma başlayın ve ardından akış hızını beş gün boyunca dakikada 35 mililitrede tutun. Daha sonra naylon tüplerin uçlarını keserek açıkça tasarlanmış greft.

Grefti, alıcı farenin anestezi uygulanmasını takiben fareye aşılamaya hazırlık olarak taze e GM iki ortam içeren bir Petri kabına dayandırın. Fareyi boynu traşlı ve uzatılmış olarak sırtüstü pozisyonda sabitleyin. Beş ila 10 kat amplifikasyon ile diseksiyon mikroskobu altında mandibuladan farenin sternumuna bir orta hat insizyonu hazırlayın.

Sağ tükürük bezlerini yanal olarak kaldırın ve sağ planör mastoid kasını çıkarın Sağ ortak karotis arteri ortaya çıkarmak için, sağ ortak karotis arteri distal uçtan proksimal uca doğru mobilize etmek için bağlı dokuları nazikçe çıkarın. Ortak karotis arterin orta kısmını sekiz sıfır ipek sütürle iki kez bağlayın ve iki lastik arasında diseksiyon yapın. Her kapta otoklavlanabilir naylon tüpten yapılmış bir manşetten geçirin.

Her bir ucu mikro hemostat klempleri ile sonlandırın ve sabitleyin. Daha sonra bir ucundaki dikiş bağlarını çıkarın ve hemen ardından bir damla heparin uygulayın. Tüm manşet gövdesini kaplayacak şekilde arterin distal ucunu ters çevirin ve ters çevrilmiş damarı manşete sekiz sıfır ipek sütür ile sabitleyin.

Aynı işlemi arterin diğer kısmına tekrarladıktan sonra, kan pıhtılarını gidermek için arteri tuzlu su çözeltisi ile çalkalayın. Daha sonra, hücreden arındırılmış damar uçlarını arter manşetinin üzerine kaydırarak ve sekiz sıfır ipek sütürle sabitleyerek karotis arterin iki ucu arasına hücreden arındırılmış bir damar grefti implante edin. Greftin nabzını değerlendirmeden önce her iki ucundan vasküler kelepçeleri çıkarın, ardından sağ siv bezini orijinal konumuna geri bağlayın.

Altı sıfır prolaktin sütür kullanarak kesintili bir dikişle cerrahi bölgedeki cildi kapatın. Metin protokolü temsilcisinde açıklandığı gibi ameliyat sonrası bakıma devam edin. PIPS hücrelerine dört günlük yeniden programlamadan sonra insan fibroblastlarının morfolojisi burada gösterilmektedir.

PIPS hücreleri, fibroblastlarla karşılaştırıldığında belirgin şekilde farklı bir fenotip sergiledi. Beklendiği gibi, tüm aort decellularizasyonu iki saat boyunca SDS ile tedavi edilerek sağlandı. Sonuç olarak, hücreden arındırılmış aort, yeni alınmış bir aort ile karşılaştırıldığında yarı saydam bir aselüler iskele olarak ortaya çıktı.

Decellularized aort içinde PIPS hücrelerinin ikili tohumlanmasını takiben, tasarlanmış vasküler greftler, decellularized damar greftlerinden farklı olarak endotelyal ve düz kas hücresi özellikleri gösterir. Bu, burada endotel hücreleri için yeşil leke ve düz kas hücreleri için kırmızı leke ile görselleştirilir. PIPS hücre damarı greftleri ile aşılanan fareler, beklendiği gibi transplantasyondan üç hafta sonra% 60'lık bir sağkalım oranı sergiledi.

Hücresizleştirilmiş damarlarla aşılanan fareler, geliştirilmesinden sonraki ilk gün kadar erken bir tarihte belirgin şekilde daha yüksek ölüm oranları ile sunuldu. Bu teknik, kardiyoloji alanındaki araştırmacıların, fonksiyonel doku mühendisliği vasküler kanalların oluşturulmasında PIPS hücrelerinin ve hücrelerden arındırılmış damar greftlerinin kullanımını keşfetmeleri için bir yol açtı. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerden arındırılmış damar greftinin nasıl hazırlanacağı, biyoreaktörün nasıl monte edileceği ve çekilen greftin farelere nasıl geri implante edileceği hakkında iyi bir anlayış kazanabileceğinizi umuyorum.