ניצול Murine עין מתנהל הטלומרז אללים במחקרים של ניוון רקמה / התחדשות והסרטן

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לתפעל שני אללים הניתנים להשראה של עכברים לדפוק מייס in vivo ו-in vitro למחקרים של ניוון והתחדשות רקמות ומחקרי סרטן. זה מושג על ידי השתלת טבליות טמוקסיפן הידרוקסי בבעלי חיים כדי להפעיל מחדש את המיימס in vivo. כצעד שני, תאי גזע עצביים מבודדים מבעלי חיים שמטופלים לאחר מכן בהידרוקסי טמוקסיפן כדי להפעיל מחדש את המאסה במבחנה.

הקרינה הבאה של טלומרים ב-C שתי הכלאות או דגים מבוצעת הן על תאים מתורבתים והן על רקמות מוח משובצות פרפין פורמליות וקבועות על מנת לבדוק את פעילות המאסה. התוצאות הראו כי טיפולי הידרוקסי טמוקסיפן יכולים להפעיל מחדש את פעילות המאסה, מה שיכול גם להקל על פנוטיפים מזדקנים וגם לקדם היווצרות גידול על סמך בדיקה היסטופתולוגית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי ההזדקנות והסרטן, כגון האם אנו יכולים להאט את תהליך ההזדקנות על ידי ויסות פעילות הטראומה של TH, או כיצד למקד את תומס באופן ספציפי לטיפול בסרטן.

מי שידגים את ההליך הזה יהיו המדריך ד"ר טקאשי שינגו וטכנאי אפריל און מהמעבדה שלי. התחל הליך זה עם יצירת האללים של Turt ER ונעילת עצירת נעילה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, עקר את כל הכלים הכירורגיים לפני ההזרקה המשך להרדמת העכברים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הגעה להרדמה עמוקה, הסר את החיה המורדמת מתא האינדוקציה והשאיר את ראשו בתוך הצינור המחובר לתא איזו פלואור.

צבטו את כריות כפות הרגליים של העכברים כדי להבטיח שהחיה מורדמת עמוק. שים גם משחה על שתי העיניים על מנת למנוע מהעיניים לצאת החוצה, נגב את גב העכברים בתמיסת יוד פובידון. לאחר מכן, הזריק כדור הידרוקסי טמוקסיפן בשחרור איטי עם טרוקר מדויק מתחת לעור הגב.

ודחף את הגלולה עד לקו האמצע בין שתי כתפיים. אטמו את החתך בעזרת קליפ פצע ועקבו אחר העכברים להתאוששות. להרדמה.

הוציאו את מוחות העכברים ליום אחד ושמרו על ארבעת המוחות על ידי הסרת פקעות הריח והמוח הקטן. שמור את ארבע רקמות המוח במיליליטר אחד של מדיום תרבית קרה, ואחסן בארבע מעלות צלזיוס. הקפידו לעבד את הרקמה העצבית תוך שעה.

קבע את משקל הרקמה כדי לוודא שלא תחרוג ממגבלת 400 מיליגרם לעיכול. הניחו את המוח על מכסה של צלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר ומחצו את המוח באמצעות אזמל. בעזרת קצה פיפטה של מיליליטר אחד, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת מלח האיזון של האנק או HBSS.

לאחר מכן פיפטה את החלקים בחזרה לצינור של 15 מיליליטר לאחר שטיפה עם צנטריפוגה HBSS ב -300 פעמים G למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הסופרנטנט בזהירות, הוסף 1,950 מיקרוליטר של אנזים שחומם מראש. מערבבים אחד לכל עד 400 מיליגרם רקמה.

דגרו את הדגימה בצינור של 15 מיליליטר למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מערבבים את הדגימה על ידי היפוך או ניעור הצינור כל חמש דקות. לאחר מכן הכינו 30 מיקרוליטר של אנזים מערבבים שניים לכל דגימת רקמה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר תמיסה, שלושה עד 10 מיקרוליטר תמיסה ארבע.

לאחר מכן מוסיפים לדגימה, הופכים בעדינות כדי לערבב, מנתקים את הרקמה באופן מכני באמצעות פיפטת משחה מלוטשת אש רחבת קצה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים, הימנעות איטית מהיווצרות בועות אוויר. יש לדגור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולהפוך את הצינור כל שלוש דקות. לאחר מכן, החל את תרחיף התאים על מסננת תאים של 70 מיקרון המונחת על צינור של 50 מיליליטר.

מרחו 10 מיליליטר של מי מלח חוצצים פוספט או PBS דרך מסננת התאים. לאחר מכן השליכו את מסננת התאים וצנטריפוגה את מתלה התאים ב -300 פעמים G למשך 20 דקות. קבעו את טמפרטורת החדר לאחר הצנטריפוגה שאבו לחלוטין את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים עם מדיום תאי גזע לנפח הנדרש ליישומים נוספים להפעלת מערך טלה במנעולים, נעילת עצירה. תאי גזע עצביים טורט. טפל בתאים עם 100 טמוקסיפן הידרוקסי מיקרו-מולרי למשך יומיים כדי להפעיל תאי גזע עצביים של emase ו-turt.

שמור את התאים במדיום תרבית עם 100 טמוקסיפן הידרוקסי מיקרומולרי לביצוע דגי טלומרים. ראשית, הכינו את כרומוזומי המטאפאזה מתאים מתורבתים עבור פורמלין קבוע ופרפין משובץ רקמות או FFPE. יש לחלק את הדגימה בקסילן ולהתייבש בסדרת אתנול למשך חמש דקות כל אחת וב-PBS למשך חמש דקות.

לאחר מכן קבע את החלקים ביחס של שלושה לאחד של מתנול לחומצה אצטית למשך שעה עד שעתיים. יבש את החלקים בסדרת אתנול קרה למשך חמש דקות כל אחד ושטוף יבש באוויר ב-XPBS אחד ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הבא בטבע, הכרומוזומים בפורמלדהיד 4% ב-37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות.

ייבשו את החלקים בסדרת אתנול קרה כמו קודם וייבשו באוויר לאחר הייבוש, מרחו 12 עד 25 מיקרוליטר מתערובת הכלאת חומצות הגרעין הפפטידיות על כל שקופית. אטום את החלקת הכיסוי עם מלט גומי המפרסם הכנות כרומוזומליות טבעיות וקטעי רקמות ב-80 מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות. לאחר מכן הכלאה בטמפרטורת החדר או 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות בתא לח.

לאחר מכן, שטפו את הדגימות בטמפרטורת החדר עם מאגר כביסה למשך 15 דקות פעמיים. לאחר מכן שטפו אותם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות עם PBS וטווין 23 פעמים. לבסוף, כתם את השקופיות עם DPI או פלואורסצנציה אדומה רחוקה לבדיקה מיקרוסקופית.

כאשר הטלומר הופעל מחדש באופן זמני בעכברים לא מתפקדים של טלומר, ניתן היה לשפר את הפנוטיפים הניווניים במספר איברים כמו המוח והאשכים כדי לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש של הטלומרים על התאים. תאי גזע עצביים שגודלו במבחנה בודדו מעכברי G ארבעה מנעולי נעילה מהדור המאוחר, TURT ו-G ארבעה עכברי ER. כאשר הטלומרים הופעל מחדש בתאי גזע עצביים לא מתפקדים של טלומרים, יכולת החידוש העצמי גדלה מאוד.

נוירוגנזה במבחנה שופרה באופן משמעותי גם כדי לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש של מייז על גידול בהקשר של תפקוד לקוי של טלומר, הפעלה מחדש של מייז על ידי טיפול בטמוקסיפן בוצעה במודל גידול ערמונית. מודל לימפומה של תאי T אנדוטיים. הטיפול הביא לשיפור משמעותי בגידול בשני המודלים.

לבסוף, דגי טלומר בוצעו על FFPE, רקמות מוח של עכבר וכרומוזומי מטפאזה. בתמונות אלה, אדום מציין DNA ירוק מציין צביעת טלומרים, וציאן מציין צביעת צנטרומר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפעיל פעילות טראומה ב- mTOR ER ונעילת עצירה, חיות mTOR וקווי תאים, וכיצד להשתמש בהם כדי לחקור את השאלות שלך בסרטן וסוכן.