Assay זול, Scalable התנהגות למדידת אתנול הרגעת רגישות וסובלנות מהירה ב דרוזופילה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את הרגישות להרגעת אתנול בזבובי פירות. זה מושג על ידי הנחת זבובים בבקבוקונים וחשיפתם לאדי אתנול. השלב השני הוא לקבוע את מספר הזבובים המרדימים בכל בקבוקון בנקודות זמן חוזרות עד שכל הזבובים מורדמים.

לאחר מכן, נקודת הזמן עוברת אינטרפולציה. כאשר 50% מהזבובים מרדימים עבור כל בקבוקון, התוצאות מראות אינדקס של הזמן הנדרש להרגעת זבובי פירות עם אתנול המדגים את ההליך הזה היום יהיה סימרן סינדו, סטודנט במעבדה שלי. כדי להתחיל את הניסוי, אספו זבובים בבקבוקוני מזון טריים בקבוצות של 11 ממין יחיד למשך עד חמש דקות של CO2, אפשרו לזבובים להתאושש במהלך הלילה בבקבוקוני מזון בחלל מבוקר סביבתי.

הכן תמיסת אתנול על ידי דילול אתנול טהור 100% במים מטוהרים לריכוז סופי של 85%אפשר לתמיסה לחזור לטמפרטורת החדר למשך הלילה לפני הבדיקה הכינו בקבוקון מזון נקי וריק, שישמש כבקבוקון הבדיקה. פקק אצטט תאית חדש, פקק סיליקון ומיליליטר אחד של תמיסת אתנול לכל בקבוקון זבובים שייבדק, התאם את טמפרטורת החדר ל-20 עד 25 מעלות צלזיוס ואת הלחות היחסית ל-55 עד 65% ייעד עובד אחר להקצות קוד ייחודי לכל קבוצת בקבוקונים ולרשום את הקוד למיקום מאוחר יותר של בקבוקונים מקודדים עם זבובים בחדר הבדיקה כדי להתאקלם למספר דקות. לאחר מכן, סמן את בקבוקוני הבדיקה הריקים כך שיתאימו לקודים שעל בקבוקוני הזבוב.

בנה יומן בדיקות עותק מודפס על ידי הזנת הקודים לעמודות עם עמודה אחת לכל בקבוקון בגיליון אלקטרוני. שימוש ביומן הבדיקות כמדריך. סדרו את בקבוקוני המזון המקודדים עם הזבובים ואת בקבוקוני הבדיקה הריקים למערכים תואמים בחדר הבדיקה, העבירו את הזבובים מבקבוקוני המזון לבקבוקוני הבדיקה התואמים והמסומנים, אחד בכל פעם.

לאחר מכן הכנס מיד פקקי אצטט תאית לבקבוקוני הבדיקה עד שתקעי אצטט התאית נמצאים שני סנטימטרים מתחת לחלק העליון של הבקבוקון. עבור הערכת זמן אפס. אחוז בכל בקבוקון בנפרד באגודל ובאצבע.

הקש בעדינות על השולחן שלוש פעמים כדי להפיל את הזבובים לתחתית הבקבוקון. המתן 30 שניות וספור את מספר הזבובים שאינם זזים או מתים. רשום את מספר הזבובים המתים ללא תנועה עבור כל בקבוקון בכל פעם.

אפס דקות ביומן הבדיקות של העותק המודפס. הפעל את הטיימר בזמן אפס והוסף מיד מיליליטר אחד של אתנול לאצטט התאית. מחבר תנועה מעגלית במרווחים של חמש שניות עבור הסט הראשון של ארבעה בקבוקונים בסדר.

הם ייבדקו כאשר האתנול יתווסף לכל ארבעת בקבוקוני הבדיקה בערכה. הכנס פקק סיליקון לכל בקבוקון כדי לאטום אותו תוך 1, 2, 3, 4 וחמש דקות. הוסף מיליליטר אחד של אתנול לסט השני, השלישי, הרביעי, החמישי והשישי של ארבעה בקבוקונים בהתאמה.

המשך להכניס פקקי סיליקון לאחר הוספת אתנול לכל סט של ארבעה בקבוקונים LS בשש דקות. בדוק את הסט הראשון של ארבעת הבקבוקונים על ידי אחיזה בכל בקבוקון עם אגודל ואצבע מורה והקשה עדינה על השולחן שלוש פעמים כדי להפיל זבובים לתחתית הבקבוקון. המתן 30 שניות, ולאחר מכן ספור ורשום את המספר הכולל של זבובים שעברו הרדמה.

זבובי ניקוד כמרדימים אם הם, אחד, עומדים על רצפת הבקבוקון, אך אינם הולכים או שניים שוכבים על גבם עם או בלי נפנוף בכנפיים. טפל בכל בקבוקון בתוך הסט במרווחים של חמש שניות באמצעות לוח זמנים זה בכל פעם. 7, 8, 9, 10 ו-11 דקות.

בדוק את סט הבקבוקונים השני, השלישי, הרביעי, החמישי והשישי בהתאמה כפי שנעשה עבור הסט הראשון לאחר 12 דקות. בדוק שוב את הסט הראשון של ארבעה בקבוקונים והמשך לבדוק את הסט השני, השלישי, הרביעי, החמישי והשישי של הבקבוקונים ב-13, 14, 15, 16 ו-17 דקות בהתאמה. המשיכו לבדוק את הזבובים עד שכולם יורדמו.

הזן את המספר הכולל של זבובים בכל בקבוקון בבדיקת העותק המודפס. חיישן יומן זבובים לא ניידים או מתים בזמן אפס ממספר הזבובים הכולל. נתונים גולמיים מבדיקת הרגעת אתנול הומרו לאחוז הזבובים הפעילים כפונקציה של זמן.

הרגישות להרגעת אתנול מהנתונים הראשוניים כומתה כזמן הרגעה 50 או ST 50. הזמן הדרוש ל-50% מהזבובים להיות מרדימים או אזור מתחת לעקומה או UC. הבדיקה מזהה את ההשפעות של RNAi כנגד קלנקסין 14 D במערכת העצבים, מה שהקהה את הרגישות לאתנול ביחס לבקרות, מוטציה של גלד ומעורר, רגישות מוגברת להרגעת אתנול ומוטציה של Happy Hour. רגישות קהה להרגעת אתנול בהשוואה לבקרות לאחר שליטה.

טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעה וחצי אם היא מבוצעת כראוי.