Name: Isolierung und Kryokonservierung von neonatalen Rattenkardiomyozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Lernen Sie die Kryokonservierung neonataler Rattenkardiomyozyten für kardiovaskuläre Forschung. Diese Methode ermöglicht die Wiederverwendung aufgetauter Zellen in In-vitro-Assays ohne wiederholte Isolation.

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Diese Arbeit wurde mit Mitteln der American Heart Association 12BGIA12040477, des Faculty Excellence Program des Kanzlers der NC State University und der National Natural Science Foundation of China H020381370216 unterstützt.

Das folgende Protokoll wird für die Isolierung von Kardiomyozyten aus einem Wurf von neonatalen Ratten-Jungen (10-14 Jungtiere) ausgelegt. Wenn die Wurfgröße signifikant unterschiedlich, kann das Verfahren müssen so skaliert, zu kompensieren. Die Welpen sollten um 48 ± 6 Stunden alt sein. Alle Verfahren hierin sind von der North Carolina State University Institutional Animal Care und Verwendung Committee (IACUC) genehmigt worden. 1. Zell Isolierung Vorbereitung HINWEIS: Führen Sie folgende Schritte am Tag vor Isolation. <ol><li> Autoklavieren Sie die folgenden: große Schere, eine kleine Schere, kleinen scharfen Zangen, große Zange. Verwenden einer Fließzyklus für 60 min bei einem Minimum von 121 ° C und einer Trocknungszeit von 30 min. </li><li> Die 40 ml 0,1% Trypsin-Lösung im Kühlschrank auftauen O / N. Kühlen Sie Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS) falls noch nicht kalt. Bereiten Sie eine 20% fötalem Rinderserum (FBS) stock Media-Lösung. <ol><li> In 400 ml IscOve modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) werden 100 ml FBS, 5 ml L-Glutamin (200 mM), 2,5 ml Gentamicin (10 mg ml -1) und 0,9 ml 2-Mercaptoethanol. Sterilisieren mit Vakuumfilter. Speichern von Medien bei 4 ° C für bis zu 3 Wochen und dies ist für kleinere oder größere Volumina skalierbar. Verdünnen Sie 20% FBS Lager Medien 1: 1 mit IMDM zu 10% FBS NRCM Medien zu produzieren. Nur in kleinen Chargen zu machen wiederholte Aufheizen und Abkühlen der Medien verhindern. </li></ol></li></ol> 2. Zellisolation Tag 1 <ol><li> Führen Sie die folgende Arbeit in einer Kultur Haube, um eine Kontamination der Proben zu verhindern. Für beste Timing starten diese Arbeit am Nachmittag, da gibt es eine O / N Inkubation. </li><li> Bereiten Sie Arbeitsbereich in einem sterilen Kultur Kapuze. Zeigen Bank Pad in Kultur Kapuze. Füllen zwei 250 ml-Becher mit 70% Ethanol und platzieren chirurgische Werkzeuge in ihnen. Legen Sie kleine Eimer Eis in Kapuze. Stellen Sie sicher, dass es groß genug, um mehrere Rohre und ein 150-mm-Schale zu halten ist. UV entkeimen die Haube for 10 min. Die 40 ml 0,1% Trypsin auf Eis. </li><li> Abrufen neonatalen Rattenjungen von der Mutter. Um die Tiere bis zur Verwendung warm zu halten, legen Sie sie in einem isolierten Behälter wie einem Eiskübel in einer Bank-Pad, um sie warm eingewickelt. </li><li> Füllen Sie eine 150 mm Kulturschale mit 25 ml HBSS und setzen auf Eis. Packen Sie 2-3 Gaze-Pads und Platz im Arbeitsbereich. Halten Welpe von der Haut auf der Rückseite des Halses, sprühen Sie es mit 70% Ethanol und in Kapuze. HINWEIS: Um beste halten Sterilität, dies kann durch eine andere Person, dann legt das gereinigt Welpen in der Haube erfolgen. </li><li> Halten den Welpen von der Haut auf der Rückseite des Halses. Dann mit den großen Scheren, in einem schnellen, starken Schnitt durch Enthauptung einschläfern. Tupfen Sie das Blut mit Gaze. HINWEIS: Aufgrund der eher Abweichungen in IACUC Anforderungen kann es sinnvoller sein, den Welpen mit einem Ethanol reinigen wischen als Besprühen. Achten Sie darauf, mit der Universität IACUC auf ihre Leitlinien für diesen Schritt zu überprüfen. </li><li> Weiter Senkung vorderen Seite chdurch den Brustkorb est. Drücken Sie die Haut am Hals, um den Brustkorb zu öffnen, bis das Herz ist sichtbar. Mit den kleinen Schere, entfernen Sie das Herz und in den HBSS Kulturschale auf Eis. Wiederholen Sie für die anderen Welpen. </li><li> Entfernen Sie alle nicht-Herzgewebe aus den Proben und schwenken Sie die HBSS sanft um das Herz zu waschen. Übertragen Sie das Herzgewebe zu einem anderen Kulturschale mit frischem HBSS und das Gewebe weiter zu waschen. Schneiden Sie das Gewebe weiter, bis die Stücke 1-3 mm 3, und dann auf die Trypsin-Lösung übertragen. Zeigen Trypsinlösung auf Wippe in 4 ° C Kühlschrank O / N. </li></ol> Zellisolation Tag 2 HINWEIS: Während Ansaugen in den folgenden Schritten, mit einer Pipette, anstatt eine Unterdruckleitung. Das Gewebe bewegt sich leicht, und eine Vakuumleitung verstopfen oder zu entfernen Gewebe noch die Zellen enthält. Es empfiehlt sich, eine Pipette zum Ansaugen zu verwenden. Wenn Gewebe in die Pipette, Pipetten wieder heraus, um sie zu entfernen. <ol><li> Stellen trei Teilmengen von 10% NRCM Medien: eine mit 25 ml und zwei mit 15 ml. Setzen Sie einen 25-ml-Tube von Medien im 37 ° C Wasserbad. 4 ml HBSS zu 5 verschiedene 15 ml konische Röhrchen und setzen alles auf Eis. Beschriften Sie jedes 15-ml-Tube # 1-5. </li><li> Man fügt 40 ml HBSS in ein 50 ml konischen Röhrchen. 10 ml HBSS, um Kollagenase, Pipette zu unterbrechen, und kombinieren Sie die Lösungen für 50 ml von 1 mg ml-1 Kollagenase-Lösung zu erstellen. Sterilisieren mit 0,22 um Vakuumfilter, und speichern Sie bei RT. </li><li> Abrufen Herzgewebe / Trypsin Rohr. Stellen Sie sicher, dass Trypsin ist klar, und das Gewebe wird locker. Lassen Sie das Gewebe auf Ecke Rohr und saugen so viel Flüssigkeit wie möglich zu regeln. </li><li> 25 ml warmem 10% FBS NRCM Medien auf das Rohr und Wirbel mit der Hand. Cap und drehen in 37 ° C Wasserbad für 2 Minuten. Flüssigkeitsaufnahme wieder. Das Gewebe sollte bei diesem Schritt zu schweben; wenn ja, Aspirat vom Boden des Röhrchens. </li><li> 10 ml Kollagenase. Drehen im Wasserbad für 2 Minuten oder bis die Lösung trüb. Quickly saugen die Flüssigkeit. 10 ml frisches Kollagenase zu Rohr das Gewebe enthält, und drehen Sie im Wasserbad für 2 Minuten. Pipette zu mischen, Transfer Lösung Rohr # 1, und setzen auf Eis. Es kann nicht möglich sein, die gesamte Flüssigkeit zu entfernen. Die Schritte 3,2-3,6 für die anderen drei 15 ml konischen Röhrchen. Die zurückbleibende Flüssigkeit zu Rohr # 5. </li><li> Zentrifuge 15-ml-Röhrchen bei 410 rcf für 8 min. Während der Zentrifugation, legen 15 ml 10% FBS NRCM Medienrohr im Wasserbad. Die 40 &amp; mgr; m Zellsieb auf einem 50 ml konischen Röhrchen und nass mit 2 ml kaltem HBSS. </li><li> Absaugen Überstand von Zellen zentrifugiert. 6 ml kaltem HBSS zu jedem Röhrchen und resuspendieren. Pipette Zellsuspensionen durch das Sieb in 50 ml konischen, jede Gewebe zu entfernen. Spülen Seiten jedes 15-ml-Röhrchen mit 3 ml kaltem HBSS und in den Sieb. Zentrifugenzellen bei 410 RCF für 10 min. Überstand entfernen. Resuspendieren Zellpellet in 10 ml 10% FBS NRCM Medien und Übertragung auf T-75-Kolben. Spülen konisch mit 5 ml Medium und in den flwie k. </li><li> Inkubieren für 1 h bei 37 ° C und 5% CO 2. Zeigen letzten 15 ml 10% FBS NRCM Medienrohr in Wasserbad. Übertragen Sie Inhalte der T-75 auf ein neues T-175-Kolben gründlich T-75 mit 15 ml Medien und in den T-175. Inkubation für 1 Std. </li></ol> 4. Kryokonservierung <ol><li> Zeigen gefrierenden Medien auf Eis. Übertragen Zellmedien von T-175 von 50 ml konischen Röhrchen und sammelt 10 ul Zellsuspension zur Zellzählung unter Verwendung von Trypan Blau. Zentrifuge bei 410 rcf für 5 min. Während der Zentrifugation zählen Zellen mit einem Zellzähler. </li><li> Aspirat Kulturmedien und Zellen in Gefriermedium in einer Konzentration von 2-4 Millionen Zellen pro ml. Zeigen 1 ml Zellsuspension in kryogene Fläschchen, dann Ort Fläschchen eine kontrollierte Abkühlgeschwindigkeit Einfriergeräte, und in -80 ° C Gefrierschrank O / N. Innerhalb von 1-2 Tagen, Transfer Ampullen in flüssigem Stickstoff. </li></ol> 5. Auftauen Cells <ol><li> Coat Gericht in Fibronektin durch Auflösen von 250 ul60; von Fibronektin (Stammkonzentration 1 mg ml -1) in 9,75 ml Wasser (Endkonzentration 0,025 mg ml -1). Fügen Sie genug Lösung für Kulturplatte abdecken und bei 37 ° C für mindestens 30 min. <ol><li> In vier 15 ml konische Röhrchen, nehmen Sie die DMSO / Medien-Gemischen als durch Zugabe von DMSO zu 20% Medien folgt. Hinzufügen (5%) 9,5 ml Medium mit 500 &amp; mgr; l DMSO. Hinzufügen (2,5%) 9,75 ml Medium mit 250 &amp; mgr; l DMSO. 10 ml Medium (machen zwei von ihnen). </li></ol></li><li> Erhitzen Sie die genannten Medien Mischungen in 37 ° C warmes Wasserbad. Entfernen Zellen aus flüssigem Stickstoff und setzen auf Trockeneis. Wenn Medien Mischungen sind warm, tauen Zellen in 37 ° C warmes Wasserbad bis kurz aufgetaut. Lassen Sie keine Zellen im Wasserbad zu lange, da dies zu Schäden an den Zellen verursachen. </li><li> Übertragen Sie Inhalte kryogene Fläschchen zu 5% DMSO / Medienrohr. Zentrifuge bei 410 rcf für 8 min. Überstand entfernen lassen Zellpellet. Hinzufügen Inhalt von 2,5% DMSO / Medienrohr zu Pellets und r Zelleesuspend. Zentrifuge bei 410 rcf für 8 min. Überstand entfernen lassen Zellpellet. </li><li> Inhalt einer 0% DMSO / Medienrohr In den Pellet resuspendieren Zell. Zentrifuge bei 410 rcf für 8 min. Überstand entfernen lassen Zellpellet. </li><li> Inhalt der zweiten 0% DMSO / media In den Zellpellet resuspendieren. Nehmen Sie kleine Probe für die Zellzählung. Zentrifuge bei 410 rcf für 8 min. Während der Zentrifugation Zahl Zellen in einem Hämocytometer mit Trypanblau toten Zellen zu kennzeichnen. Nehmen Zellmenge sowie Rentabilität. </li><li> Überstand entfernen lassen Zellpellet. Resuspendieren in 10% NRCM Medien (optional: mit 100 &amp; mgr; M Bromdesoxyuridin (BrdU)) und Platte Zellen auf Fibronektin-beschichtete Platten. </li></ol> 6. Zellkultur <ol><li> Platten Zellen bei ungefähr 100K Zellen pro cm 2. Stellen Sie die Beschichtung Dichte basierend auf der beabsichtigten Verwendung der Kultur. Bereiten Sie 2% NRCM Medien durch Verdünnen von 20% Medien in IMDM im Verhältnis 1:10. Hier finden Sie eine Übersicht über eine typische Kultur. &lt;/ Li&gt; <li> Am Tag 1, spülen toten Zellen weg mit warmem IMDM, fügen Sie 10% NRCM (optional 100 uM BrdU). Am 2. Tag gründlich abgestorbene Zellen entfernt mit warmem IMDM, fügen Sie 10% NRCM. Tag 3-add 2% NRCM. Am Tag 4 mit 2% NRCM. Am Tag 5 zu gewährleisten, dass die Zellen konfluent und Ausklopfen wird. Pflegen Zellen in Kultur für etwa eine Woche. An diesem Punkt kann Fibroblasten beginnen, die NRCMS deutlich entwachsen. </li></ol>

<ol><li>Louch, W. E., Sheehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts+Induce+Ectopic+Activity+in+Cardiac+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue.</a> Circulation Research. 101, 755-758 (2007).</li>
<li>Simpson, P., Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+myocytes+in+single+cell+cultures+with+and+without+proliferating+nonmyocardial+cells.+Cross-striations%2C+ultrastructure%2C+and+chronotropic+response+to+isoproterenol%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol.</a> Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).</li>
<li>Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocyte+hypertrophy+in+neonatal+rat+heart+cultures+and+its+regulation+by+serum+and+by+catecholamines%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines.</a> Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).</li>
<li>Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographically+defined+deposition+of+attachment+factors+as+a+versatile+method+for+patterning+the+growth+of+different+cell+types+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive+%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture.</a> Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).</li>
<li>Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+enrichment+of+functional+cardiomyocytes+using+microfluidic+deterministic+lateral+flow+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement.</a> PloS One. 7 (5), e37619(2012).</li>
<li>Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+cardiac+myocyte+cultures+by+surface+microtopography%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).</li>
<li>Fu, J. -D., Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+the+developmental+regulation+of+Ca2%2B+transients+and+contraction+in+cardiomyocytes+derived+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).</li>
<li>Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Functional+sarcoplasmic+reticulum+for+calcium+handling+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+insights+for+driven+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation.</a> Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).</li>
<li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li>
<li>Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+temperature+range+for+low-temperature+preservation+of+dissociated+neonatal+rat+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes.</a> Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).</li>
<li>Miyamura, K., Nagayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+viability+of+cryopreserved+rat+cardiac+myocytes+and+effects+of+dimethyl+sulfoxide+concentration+on+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation.</a> Cryobiology. 59 (3), 375(2010).</li>
<li>Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+bioenergetics+and+utilization+in+safety+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%3A+An+Official+Journal+of+the+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening.</a> Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).</li>
<li>Yokomuro, H., Mickle, D. aG., Weisel, R. D., Li, R. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+heart+cell+cryopreservation+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).</li>
<li>Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocyte+hypertrophy+in+neonatal+rat+heart+cultures+and+its+regulation+by+serum+and+by+catecholamines%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines.</a> Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).</li>
<li>Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((array+analysis+of+cell+cycle+protein+changes+during+the+hyperplastic+to+hypertrophic+transition+in+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).</li>
<li>Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).</li>
<li>Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotonic+myofibroblast-to-myocyte+coupling+increases+propensity+to+reentrant+arrhythmias+in+two-dimensional+cardiac+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers.</a> Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).</li>
<li>Chang, M. G., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiral+waves+and+reentry+dynamics+in+an+in+vitro+model+of+the+healed+infarct+border+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone.</a> Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll ermöglicht die NRCMS isoliert werden, kryokonservierten und aufgetaut. Auftauen der Zellen ist ein wesentlicher Teil des Verfahrens. Eine Reihe von Verdünnungen DMSO verwendet wird, um DMSO langsam zu entfernen von den Zellen 14. Es ist wichtig, dass die Gewinnung von DMSO schnell durchgeführt werden, da die Zellen besonders empfindlich gegenüber unmittelbar sterben nach dem Auftauen sind. Wenn mehr oder weniger Zellen werden zum Auftauen erforderlich ist, kann das Volumen der DMSO-Lösungen n...

Zellkultur von Herzmuskelzellen ist ein wichtiges Werkzeug in der modernen Herzforschung. Neonatalen Rattenkardiomyozyten (NRCMS) sind häufig, da die Isolierung verwendet und Kultur ist einfacher als die von Erwachsenen Rattenkardiomyozyten 1. Die NRCM Verfahren hat noch einige Beschränkungen einschließlich langer Isolationsverfahren und begrenzte Zellproliferation in der Schale. Es gibt zahlreiche Protokolle für die Isolierung von NRCMS meisten allgemeinen erfordern 4-48 hr Arbeits 2-6. Darüber hinaus werden die Zellen häufig 1 getrennt zu 2 Tage alten Rattenjungen 2,4-7; der Zeitpunkt der Geburt kann unberechenbar und Konflikte mit anderen Arbeit im Labor sein. Die Isolierungen kann ineffizient und verschwenderisch sein, wenn nur eine kleine Menge von Zellen für Experimente benötigt. Die meisten Anstrengungen auf die Verbesserung des Workflows konzentrieren sich auf die Verminderung der Isolation der Zeit, aber dies nicht die Probleme der Zeitmessung der Geburt der Jungtiere zu lösen. Als Alternativen vielen Labors nutzenKardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen (ESC) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) abgeleitet. Jedoch kann die Umprogrammierung und / oder Differenzierungsprozess sehr zeitaufwendig und teuer sowie sein. Es können auch andere Probleme bei der Verwendung dieser Zellen in vitro myocyte Modelle. Beide ESC- und iPSC- abgeleitete Kardiomyozyten wurde gezeigt, dass Unterschiede in der Elektrophysiologie von primären Cardiomyocyten 8-10 aufweisen. Dissoziierte NRCMS sind in der Lage, die für mehrere Tage mit Kälte 11 gespeichert, aber das bedeutet für die Langzeitlagerung zu ermöglichen. Flüssiger Stickstoff wird typischerweise verwendet, um Zellen für einen größeren Zeitraum zu erhalten, sondern erfordert ein Kryoschutzmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO). Zurück Forschung hat gezeigt, dass die ideale Konzentration zwischen 5-10% DMSO in gefrierenden Medien ermöglicht die Kryokonservierung von NRCMS, doch selbst dann ist die Überlebensfähigkeit nach wie vor gering 12. Obwohl DMSO hilft den Zellen zu schützen während der freienZing, kann giftig in Konzentrationen über 1,5% 13 sein, um Zellen. Frühere Studien haben gezeigt, dass sich langsam entfernen DMSO aus den Zellen kann die Lebensfähigkeit der Zellen 14 zu verbessern. Wir haben versucht, die Effizienz des NRCM zellbasierten Assays durch Kryokonservierung der Zellen nach der Isolierung zu verbessern. Dies ermöglicht es, die Zellen aufgetaut und bei Bedarf verwendet werden, was die Häufigkeit der Isolationen und den Verbrauch von Tieren werden. Unter Verwendung dieses Verfahrens zeigen wir, dass es möglich ist, NRCMS Kryokonservierung und Auftauen sie für die Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt. Nach dem Auftauen der Zellen zu erhalten eine akzeptable Rentabilität und produzieren NRCM Kulturen, die positiv für α-sarkomerischen Actinin (α-SA) und Vertrags spontan sind.

<table><tbody><tr><td>IMDM (+25 mM HEPES +L-Glutamin)</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td>Mit Zusatz von 25 mM HEPES und L-Glutamin</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca +Mg)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td>Mit Zusatz von Calcium und Magnesium, pH 7,1-7,4</td></tr><tr><td>Trypsin 0,25 %</td><td>Gibco</td><td>25300-056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,05 %</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td>Gefriermedien</td></tr><tr><td>Kryogene Fläschchen</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Sigma</td><td>C1889-50MG</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Cell Strainer</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisierender Vakuumfilter (0,22 μm; m)</td><td>Corning</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty Gefrierbehälter</td><td>ThermoScientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Millicell EZ&nbsp; FOLIEN</td><td>Millipore</td><td>PEZGS0416</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-sarkomerischer Actinin-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridin</td><td>BD Biosciences</td><td>51-7581KZ</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und kryokonservierung von neonatalen rattenkardiomyozyten

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Zellkulturen sind in der Herzforschung zunehmend wichtig geworden, aber aufgrund der begrenzten Proliferation von Kardiomyozyten ist die Kultivierung von Kardiomyozyten schwierig und zeitaufwändig. Die am häufigsten verwendeten Zellen sind neonatale Ratten-Kardiomyozyten (NRCMs), die jedes Mal isoliert werden müssen, wenn Zellen benötigt werden. Die Geburt der Ratten kann unvorhersehbar sein. Die Kryokonservierung wird vorgeschlagen, um die Lagerung von Zellen bis zu ihrem Bedarf zu ermöglichen, doch Einfrier-/Auftaumethoden für primäre Kardiomyozyten sind aufgrund der Empfindlichkeit der Zellen eine Herausforderung. Mit dem richtigen Kryoprotektivum, Dimethylsulfoxid (DMSO), wurde eine Kryokonservierung erreicht. Durch langsame Extraktion des DMSO während des Auftauens der Zellen wurden Kulturen mit lebensfähigen NRCMs erhalten. Der NRCM-Phänotyp wurde durch immunzytochemische Färbung auf α-sarkomeres Actinin verifiziert. Darüber hinaus zeigten die Zellen nach mehreren Tagen in Kultur auch eine spontane Kontraktion. Die Zellviabilität nach dem Auftauen lag bei 40-60 %. Trotzdem ermöglichen die beschriebenen Methoden eine einfache Kryokonservierung und Auftauung von NRCMs. Dies gibt den Forschenden ein höheres Maß an Flexibilität bei der Planung von Experimenten und reduziert den Einsatz von Tieren.

Nach der Isolierung der neonatalen Rattenherzmuskelzellen werden die Zellen bis zu flüssigem Stickstoff eingefroren und für mindestens mehrere Monate gelagert werden. Typischerweise nach dem Auftauen wird die durch Trypanblau-Analyse bestimmt Lebensfähigkeit zwischen 40-60% liegen. Obwohl diese niedriger als bei anderen Zelltypen, mit der richtigen Säen und Kultur werden die Zellen proliferieren (Abbildung 1). Um Kontraktilität zu überprüfen, können die Zellen unter Verwendung eines Phasenkontrastmikros...

Die Isolierung von neonatalen Ratten-Kardiomyozyten ist ein zeitaufwändiges und unvorhersehbares Verfahren. Diese Studie beschreibt Methoden zur Kryokonservierung und zum Auftauen von neonatalen Ratten-Kardiomyozyten, die eine effizientere Nutzung der Zellen ermöglichen. Die aufgetauten NRCMs können für verschiedene Experimente verwendet werden, ohne dass jedes Mal Isolationen durchgeführt werden müssen.

Isolierung und Kryokonservierung von neonatalen Rattenkardiomyozyten

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neonatale Rattenkardiomyozyten einzufrieren und anschließend die Zellen zum Einsatz in In-vitro-Studien wieder aufzutauen. Dies wird erreicht, indem das neugeborene Herz in kleine Stücke zerkleinert wird. Die Kardiomyozyten werden dann enzymatisch aus dem Herdgewebe gelöst, kryokonserviert und schließlich zum weiteren Zellkultivieren wieder aufgetaut. Letztendlich können die aufgetauten Zellen für verschiedene In-vitro-Assays verwendet werden, einschließlich der immunfluoreszenten Analyse der gewünschten kardialen Marker. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie Zeit spart, da keine vollständige Kardiomyozyten-Isolation durchgeführt werden muss, wenn Zellen für einen Assay benötigt werden. Eine visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist entscheidend, da die Feinheiten bezüglich der korrekten Größe und Konsistenz der Proben während der Isolations- und Verarbeitungsschritte nur schwer zu erlernen sind, ohne dass eine direkte Demonstration erfolgt.Nachdem alle neugeborenen Herzen gesammelt wurden, entfernen Sie jegliches nicht zum Herzen geh&ouml;rende Gewebe von den Proben und waschen Sie

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschreiben eine schnelle Methode zur Isolierung und Kultur hippokampalen und kortikalen Neuronen aus Nagetier Embryonen. Dieses Protokoll erlaubt es uns, Experimente, in denen nahezu reinen neuronalen Kulturen sind erforderlich, durchzuführen.

Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Nervenzellen: ein Quick-Protokoll

Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Bildgebung lebender Zellen mit primären neonatalen Kardiomyozyten von Ratten nach lentiviraler und adenoviraler Transduktion mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie. Dies ermöglicht detaillierte Beobachtungen zellulärer Prozesse in lebenden Kardiomyozyten.

Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk-

Mehrere Protokolle wurden entwickelt und beschrieben für die Isolierung von verschiedenen Herzzelltypen von einem Rattenherz. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die Isolierung von hochwertigen Hauptkardiometertypen (Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten) aus einer einzigen Präparation ermöglicht, wodurch die experimentellen Kosten reduziert werden.

Gleichzeitige Isolierung von hochwertigen Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus einem erwachsenen Rattenherz

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC). Isolierte ARVC kann für kurz- und langfristige Anbau verwendet werden. Die Isolierung und Kultivierung ARVC können eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von neuen Behandlungsschemata für kardiale Erkrankungen spielen.

Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte Kardiomyozyten

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von erwachsenen Maus- und Rattenkardiomyozyten vor.

Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von Erwachsenenmaus und Rattenkardiomyozyten

Der Goldstandard in der Kardiologie für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente sind Kardiomyozyten. Dieser Artikel beschreibt Anpassungen an die Nicht-Langendorff-Technik zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten.

Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

Diese Methode eliminiert jede größere Invasion während der Zellinjektionen, die durch die Zellsuspensionslösung verursacht wird.

Eine neuartige Zellinjektionsmethode mit minimaler Invasion

Das Rückenmark eines adulten Säugetieres enthält neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NSPCs), die in Kultur isoliert und erweitert werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Isolierung, Kultivierung und Passage von NSPCs, die aus der periventrikulären Region des adulten Rückenmarks von der Ratte und von menschlichen Organtransplantatspendern erzeugt wurden.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Satellitenzellen aus branchiomeric Kopf Muskeln über ein 9 Wochen alten Ratte. Die Muskeln aus unterschiedlichen Kiemenbögen. Anschließend werden die Satellitenzellen auf einem Spotlackierung von Millimetergröße, um ihre Differenzierung zu untersuchen kultiviert. Dieser Ansatz vermeidet die Expansion und Passagieren von Satellitenzellen.

Isolierung und Charakterisierung von Satellitenzellen aus Ratte Kopf Branchiomeric Muscles

Lernen Sie die Kryokonservierung neonataler Rattenkardiomyozyten für kardiovaskuläre Forschung. Diese Methode ermöglicht die Wiederverwendung aufgetauter Zellen in In-vitro-Assays ohne wiederholte Isolation.

Isolierung und Kryokonservierung von neonatalen Rattenkardiomyozyten

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