구현

이 프로시저의 전반적인 목표는 다양한 치료제 클래스에 대한 내성을 기능적으로 유도할 수 있는 임상적 관련성이 높은 단일 염기 변이의 신속한 전임상 발견을 촉진하는 것입니다. 이 방법은 종양학 분야의 핵심 질문, 예를 들어 어떤 유전자 돌연변이가 임상에서 치료제에 대한 기능적 내성에 기여하는지에 대한 답을 제공함으로써, 궁극적으로 치료법의 개선과 약물 내성 환자를 위한 대안적인 임상 관리 전략 수립에 가이드 역할을 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자발적 돌연변이의 발생을 촉진하고 내성 클론에 대해 편향되지 않은 스크리닝 기술을 적용하므로, 이러한 변이들이 임상에서 표적 치료제의 재발을 유도할 가능성이 더 높다는 점입니다.

세포주의 GI 50를 평가하기 위해, 저희 실험실의 숙련된 연구원이 해당 절차를 시연하겠습니다. 여기에 표시된 맵에 따라 투명 바닥 96웰 플레이트에 100 µL의 세포 배지를 사용하여 세포를 파종하여 분석 플레이트를 준비하십시오.

유사한 방식으로 대조군 플레이트를 준비하며, 파란색 웰에는 세포를 추가하고 흰색 웰에는 배지만 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 발광 세포 생존율 시약을 실온과 평형 상태로 맞추고 부드럽게 뒤집어 섞어줍니다. 균질한 용액을 얻기 위해 대조군 플레이트의 웰에 시약 80 µL를 추가하고 30분 동안 흔들어 섞습니다.

세포 용해를 유도합니다. 발광량을 기록하기 위해 노출 시간 0.1~1.0초, 검출 파장 560 nanometers로 설정된 루미노미터를 사용하십시오. 다음으로, 분석 플레이트에 테스트 화합물을 첨가하기 위해 2000 micromolar 농도부터 시작하여 DMSO에서 화합물을 1/4 연속 희석하여 총 10단계의 희석 시리즈를 만듭니다.

그런 다음, 연속 희석한 화합물을 배지에 추가하여 최종 농도의 10배가 되도록 화합물-배지 혼합물을 만듭니다. 화합물 플레이트는 분석 3일 차에 사용할 수 있도록 -20 °C에서 보관하십시오. 다음으로, 최고 용량이 10 µM이 되도록 희석된 화합물 10 µL를 세포에 3반복으로 추가합니다.

플레이트를 37 °C에서 3일 동안 배양합니다. 3일째 되는 날, 3일 전에 준비한 화합물 플레이트를 사용하여 400 µL의 1X 화합물 배지 혼합물을 준비합니다. 분석 플레이트를 뒤집어 배지를 제거하고 오토클레이브 전용 종이 타월로 2~3회 가볍게 닦아 건조시킵니다.

파란색으로 표시된 웰에 화합물 1x를 추가하고, 증발을 방지하기 위해 주변부 웰에 배지 100 µL를 추가합니다. 6일 차에, 비디오 앞부분에서 시연한 것과 같이 발광 측정을 통해 생존 세포의 상대적 수를 평가합니다. 그런 다음 PRISM과 같은 소프트웨어를 사용하여 GI 50 값을 계산하고, 계산된 GI 50 값을 바탕으로 약물 내성 분석을 위한 세포를 준비합니다.

세포 정지 제제(cytostatic agent)를 사용하는 경우, 150 mm 정사각형 배양 접시에 세포를 30~40% 합쳐짐(confluence) 상태로 분주합니다. 독성 제제(toxic agent)를 사용하는 경우에는 세포를 70~80% 합쳐짐 상태로 분주하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 초기 화합물 농도를 결정한 후, 6일간의 생존력 분석에서 세포 사멸을 유도하는 고독성 화합물에 대해 테스트 화합물을 처리하여 세포를 처리합니다.

GI 50부터 시작하여 강력한 내성이 관찰될 때까지 2~3주 간격으로 농도를 점진적으로 높입니다. 단일 세포 클론을 분리하려면, 40배 배율의 위상차 현미경으로 배양 접시를 관찰하여 접시 바닥에 있는 생존 가능한 세포 클러스터를 확인합니다. 다른 콜로니로부터 충분히 떨어져 있고 크기가 평균적인 클론을 펜으로 표시한 후, P 200 피펫을 사용하여 해당 클론을 채취합니다.

디쉬에서 배양액을 제거하고 XPBS를 사용하여 부유 세포를 씻어냅니다. 피펫 팁으로 클론을 들어 올려 0.25% Trypsin 50 µL가 들어 있는 48웰 플레이트의 웰로 옮긴 후 37 °C에서 1~2분 동안 배양합니다. 그 후, 세포가 최적으로 회복될 수 있도록 화합물 농도를 절반으로 낮춘 신선한 배양액 200 µL를 첨가합니다.

3mm 클로닝 디스크를 사용하여 클론을 분리하려면, 디스크를 0.25% trypsin EDTA 5mL가 담긴 10cm 조직 배양 접시에 2분 동안 담급니다. 다음으로, 내성 클론이 포함된 접시에서 배지를 흡입하여 제거하고, trypsin에 적신 클로닝 디스크로 클론 위를 덮습니다. 클론이 플레이트에서 떨어지는 정도에 따라 37°C에서 1~2분 동안 배양합니다.

그 다음 멸균 핀셋을 사용하여 클로닝 디스크를 집어 200 µL의 신선한 배지가 담긴 48-웰 플레이트로 옮깁니다. 화합물이 포함된 배지를 부드럽게 파이펫팅하여 클로닝 디스크에서 세포를 떼어낸 후 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 클로닝 디스크를 제거하고 세포를 배양한 후, 약물 내성을 평가합니다. 여기에서 보여주는 텍스트 프로토콜에 따르면, 세포독성 화합물 1번으로 장기간 처리된 HCT 116 세포에서는 처리 과정 중에도 지속적으로 성장하는 내성 클론이 자연적으로 출현했습니다.

클론들은 파이펫맨을 사용하여 선택되었습니다. 이 그림에서 내성 클론 1번부터 3번까지는 모두 화합물 1번과 그 밀접한 유사체인 화합물 2번에 대해 상당한 내성을 보인 반면, 모든 클론은 관련 없는 세포독성 화합물인 Velcade에 대해 민감성을 보였습니다. 표현형 내성이 확인된 후, gDNA를 분리하여 전엑솜 시퀀싱 분석에 제출하였습니다.

재발하며 기능적 영향 가능성이 있는 구조적 변이는 Sanger sequencing과 같은 독립적인 시퀀싱 도구로 확인하였습니다. 여기에 제시된 예시는 헤테로접합성 미스센스 돌연변이를 가지고 있었으며, 이후 모세포주(parental cell line)를 조작하여 돌연변이된 CDNA를 발현하도록 하였습니다. 반면, 야생형(wild type) CDNA를 과발현시켰을 때는 약물 내성이 부여되지 않았습니다.

변이 CD NA는 화합물 1번에 대해 표현형 저항성을 유의하게 부여하였으며, 이는 구조적 변이가 저항성의 원동력으로서 기능적 역할을 수행함을 확인시켜 줍니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 약물 투여 후 암세포에서 약물 저항성을 담당하는 유전자를 스크리닝하기 위해 자발적 저항성 성장을 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 종양학 분야의 연구자들이 암 세포주와 동물 모델 모두에서 편향되지 않은 방식으로 약물 저항성 기전을 탐구할 수 있는 길을 제시합니다.