Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar Salmonellen In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, den prozentualen Anteil an zytosolischen und vakuolären Salmonella tym in infizierten Makrophagen aus dem Knochenmark zu bestimmen. Dies wird durch die Infektion von Makrophagen mit M-Kirsch-exprimierenden Salmonellen Ty aerium erreicht. In einem zweiten Schritt werden die Zellen mit dem Detergens Tonin behandelt, das die Plasmamembran, nicht aber die Vakuolenmembranen durchlässig macht.

Als nächstes werden die Zellen mit einem Anti-Salmonellen-Antikörper gefärbt, der an das Fluor ofor gekoppelt ist, Zi.In zytosolische Salmonellen ty erum zu markieren, die Ergebnisse zeigen den prozentualen Anteil zytosolischer Bakterien an den Gesamtbakterien basierend auf fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder Fakten. Diese Metalle können helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Erregerinteraktion zu beantworten, wie z. B. repliziert sich ein intrazellulärer Erreger in einer VA oder im Zytosol. Impfen Sie den Bakterienstamm einen Tag vor der Infektion in drei Millilitern Luria britani Medium, ergänzt mit Streptomycin und Ampicillin, in einem Shaker bei 37 Grad Celsius über Nacht, um den individuellen Bedingungen Rechnung zu tragen. Fügen Sie Deckgläser zu den Vertiefungen einer 24-Well-Platte hinzu, die als Kontrollen verwendet werden, um die Zellen für Infektionssamen, Wildtyp-Knochenmark-Makrophagen oder BM-DMS mit einer Dichte von 0,125 Millionen Zellen pro Vertiefung in einem Milliliter primärem Makrophagenmedium zu beschichten, und inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Am nächsten Tag. Bestimmen Sie die Konzentration von Salmonellen in der Übernachtkultur, indem Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 der verdünnten Kultur gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung messen. Dadurch wird sichergestellt, dass der OD 600 im linearen Bereich des Spektralphotometers gemessen wird.

Berechnen Sie die Konzentration von Salmonellen pro Milliliter und OD 600 von eins entspricht 1 Milliarde. Bakterien verdünnen die Bakterien in Makrophagenmedium auf eine Salmonellenkonzentration von 1,25 Millionen Zellen pro Milliliter, um die Zellen mit Salmonellen zu infizieren. Entfernen Sie das Medium aus den B-MDMs.

Geben Sie einen Milliliter Makrophagenmedium in die nicht infizierten Kontrollvertiefungen, B eins bis B drei und C eins bis C3. Geben Sie dann einen Milliliter Salmonellensuspension in die Vertiefungen, A eins bis fünf, um eine Infektionsmehrheit von 10 Bakterien pro Zelle zu erreichen. Zentrifugieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei 300 mal G und 37 Grad Celsius, um die Infektion zu synchronisieren, bevor Sie die Platte eine Stunde nach der Infektion zur Inkubation mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid überführen. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator, um 0,1 Milliliter Makrophagenmedium hinzuzufügen, das Gentamycin enthält, um extrazelluläre Bakterien abzutöten.

Geben Sie Gentamycin in alle Vertiefungen, auch in die nicht infizierten Kontrollen, um sicherzustellen, dass alle Zellen auf die gleiche Weise behandelt werden. Dann geben Sie die Platte zwei Stunden nach der Infektion bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einen Inkubator. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und waschen Sie alle Vertiefungen zweimal mit einem Milliliter vorwarmem Docos, modifiziertem Eagles Medium oder DMEM.

Ersetzen Sie das DMEM durch vorgewärmtes Makrophagenmedium, das Gentamicin enthält, um das Wachstum verbleibender extrazellulärer Bakterien zu verhindern, bevor Sie die Platte kurz vor dem gewünschten Zeitpunkt der Analyse wieder in den Inkubator bringen. Bereiten Sie frische Lösungen aus KHM-Puffer, KHM-Puffer mit Ziffern und KHM-Puffer mit Saponin vor. Zusätzlich zu den Antikörperlösungen, wie im Textprotokoll beschrieben, um die Zellpermeation durchzuführen, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 0,5 Millilitern vorwarmem KHM-Puffer.

Entfernen Sie dann den KHM-Puffer und geben Sie 0,25 Milliliter einfachen KHM-Puffer in die Vertiefungen A, vier, B, eins und C, einen khm-Puffer mit Dig toin in die Vertiefungen, A eins bis A, drei, B, zwei und C zwei und khm-Puffer mit Saponin in die Vertiefungen A, fünf, B, drei und C3, inkubieren genau eine Minute lang bei Raumtemperatur, bevor Sie sofort alle Vertiefungen dreimal mit 0,5 Millilitern PREWARM KHM-Puffer waschen. Entfernen Sie abschließend den KHM-Puffer und geben Sie die primären Antikörperlösungen in die entsprechenden Vertiefungen, bevor Sie die Platte nach der Inkubation 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Waschen Sie die Zellen einmal mit einem Milliliter PBS für die infizierten Zellen in Vertiefungen, A eins bis fünf.

Bereiten Sie sich auf die Faxanalyse vor, indem Sie die Zellen dreimal mit PBS waschen. Fügen Sie dann 0,5 Milliliter eiskaltes PBS mit 0,1% Triton hinzu. Übertragen Sie als Nächstes die Zellsuspension in ein Fünf-Milliliter-Faxrohr mit einer Zellsiebkappe, um die Zellaggregate aufzubrechen, während die Proben auf Eis gehalten werden.

Analysieren Sie die Proben auf einem Faxgerät mit den vollständig durchlässigen Reglern. Stellen Sie das Gate für die Gesamtzahl der Bakterien basierend auf der Vorwärts- und Seitenstreuung und dem mCherry-Signal ein. Analysieren Sie als Nächstes das Fitz-Signal in der gesamten Bakterienpopulation unter Verwendung der Vollperme- und Nicht-Perme-Kontrollen, um die Gates für zytosolische Bakterien und vakuoläre Bakterien mit dem Gate-Set zu setzen.

Analysieren Sie die Proben und bestimmen Sie den Prozentsatz von zytosolischen im Vergleich zu vakuolären Bakterien mit der FlowJo-Software. Bereiten Sie sich gemäß dem Protokoll des Herstellers für die nicht infizierten Permeationskontrollen in den Vertiefungen B eins bis B, drei und C eins bis C3 auf die Mikroskopie vor, indem Sie das PBS entfernen und 250 Mikroliter 4%-Paraform-Aldehyd in PBS-Inkubation für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius nach der Inkubation geben. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit einem Milliliter PBS und bei 250 Mikrolitern 0,1 molar Glycin in PBS für 10 Minuten, um das Fixiermittel abzuschrecken, und waschen Sie dann die Vertiefungen zweimal mit einem Milliliter PBS, um eine sekundäre Antikörperfärbung durchzuführen.

Färben Sie die Permeationskontrollen eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit geeigneten Sekundärantikörpern, die an Fluor-Vier-Antikörper in PBS gekoppelt sind. Das wird mit 0,1 % Saponin und 3 % BSA ergänzt. Um die Zellen vollständig zu permatieren, waschen Sie die Deckgläser dreimal mit einem Milliliter PBS und montieren Sie die Deckgläser für die Analyse in Eindeckmedium mit dappy.

Analysieren Sie die Deckgläser mit den Bedienelementen bei 40-facher oder 63-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Hier sind typische Fakten dargestellt. Die Ergebnisse positiver und negativer Kontrollen werden verwendet, um die Gates für m kirschpositive, Fitz-positive Bakterien, die zytosolisch sind, Salmonellen, und m kirschpositive FITSI-negative, d. h. valare Salmonellen, zu setzen.

Basierend auf diesen Gates wird der prozentuale Anteil an zytosolischen und vakuolären Bakterien in den Versuchsproben bestimmt. In diesem Beispiel wird der m-kirschpositive Salmonella typhimurium-Wildtyp mit einer CA-Deletionsmutante in aus dem Knochenmark abgeleiteten MI-Makrophagen verglichen, die hier gezeigt werden, ist Kexin und PD. Eine Färbung, die in Permeationskontrollen erhalten wird, die mit digit, toin oder Saponin behandelt wurden, da Calnexin ein ER-Membranprotein ist, ist eine Calnexin-Färbung im gesamten Zytosol und um den Zellkern sowohl in digit-toin- als auch in Saponin-Perme-Zellen zu sehen. In der Digit-to-Perme-Kontrolle ist keine PD eine Färbung sichtbar.

Während die Färbung in Sasin- und Perme-Zellen beobachtet werden kann. Hier ist ein Ergebnis der Anti-Salmonellen-Färbung in Zellen zu sehen, die mit Tonin dauerwellig waren. Die Gesamtzahl der Bakterien ist rot, während die zytosolischen Bakterien grün sind.

Bei der E-positiven Population handelt es sich um Salmonellen mit Zugang zum Zytosol. Während es sich bei der fite-negativen Population um Bakterien handelt, die wir in einer intakten Salmonelle mit Vakuole oder SCV beheimatet haben und daher hier vor der FSE-Markierung von Salmonellen geschützt sind, wird Wildtyp-Salmonella mit einem CFE-Deletionsmutantenstamm verglichen. Da CA für Salmonellen notwendig ist, um die SCV-Integrität aufrechtzuerhalten, ist ein erhöhter Prozentsatz an Salmonellen Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Prozentsatz an vaskulären und zytosolischen Bakterien bestimmen können.