ポリマー/フラーレンナノ粒子の光増感を実施ブレンドと光線力学療法

次の実験の全体的な目標は、光線力学療法またはがん治療におけるPDTアプリケーションのための次世代光増感剤を開発することです。これは、水分散性導電性ポリマーナノ粒子を作るための沈殿法を適応させることによって達成されます。第2のステップとして、ナノ粒子をin vitroでがん細胞とインキュベートした後、光で処理して、PDTに関与する活性ラジカルである活性酸素種(ROS)を生成します。

次に、治療の有効性を定量的アッセイと定性的イメージングによって評価し、細胞集団の生画分とTED画分を決定します。その結果、OAR 3によってモデル化された卵巣がんなどの侵攻性がんは、この研究で報告されたナノ粒子光増感剤を豊富に取り込んでおり、PDT治療がin vitroで非常に効果的であることを示しています。その場合、PDTの有効性は、さまざまな細胞株が取り込むナノ粒子の量と直接相関します。

化学療法、放射線療法、手術などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、治療が副作用を軽減するために疾患部位に特異的に標的にできることです使用される活性材料は、in vitroの細胞毒性を示さず、さらなる開発によりナノマテリアルシステムがtDCS部位に対してより特異的になります。この手順は、細胞株の培養と、テキストプロトコルに記載されているM-E-H-P-P-Vストック溶液の調製から開始します。50マイクロリットルの原液M-E-H-P-P-Vストック溶液を3ミリリットルのTETRAHEDRANまたはTHFに加えます。

この溶液を希釈M-E-H-P-P-Vストック溶液としてラベル付けし、1センチメートルの石英Qベットに移し、紫外可視分光法で495ナノメートルの吸光度を測定します。希釈したM-E-H-P-P-V原液の吸光度が0.17より高い場合は、495ナノメートルでの測定吸光度が0.13〜0.17の範囲になるまで、TH F1ミリリットルを一度に追加して希釈してください。次に、M-E-H-P-P-V-P-C-B-Mをブレンドした1ミリリットルの溶液を針を取り付けた1ミリリットルの注射器に移すことにより、沈殿法によりナノ粒子を調製します。ずんずん。

1ミリリットルのM-E-H-P-P-P-V-P-C-V-M溶液を4ミリリットルの脱イオン水に注入し、注入直後の停止時に1200rpmで攪拌します。これらのナノ粒子を追加処理せずに使用して、ナノ粒子でインキュベートした細胞でPDTを実行します。まず、テキストプロトコルに示されているように、96ウェルプレートのセットを標識します。

次に、培地を取り出し、ドコスリン酸緩衝生理食塩水またはDPBSで細胞を2回洗浄し、続いて0.05%トリンで10分間細胞をインキュベートすることにより、培養フラスコから細胞を採取します。溶液を適切に混合して、細胞クラスターを一重項に分離します。100マイクロリットルの細胞懸濁液を取り、10%FBSを添加した900マイクロリットルのDMEMに加え、よく混ぜて、この懸濁液の10マイクロリットルをヘモサイトメーターに置きます。

ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、細胞懸濁液の濃度をミリリットルあたり50, 000細胞に調整します。次に、50マイクロリットルの細胞溶液をウェルに追加して96ウェルプレートに播種し、ウェルごとに2,500個の細胞を播種します。次に、調製したナノ粒子懸濁液の2100マイクロリットルおよび180マイクロリットルをDMEMに添加することにより、異なるナノ粒子濃度を調製し、最終容量2ミリリットルを得る。

24時間後、1つのX-D-P-B-Sでウェルを洗浄し、ウェル内のナノ粒子の濃度が増加する50マイクロリットルで洗浄します。各細胞株は、ナノ粒子の濃度ごとにトリプリケートを持っています。ナノ粒子のエディションから24時間後。

1つのX-D-P-B-Sで細胞を洗浄し、各ウェルに50マイクロリットルのハンク平衡塩溶液またはHBSSを加えて、細胞を照射し、ソーラーシミュレータのランプを15分間温めます。ランプの前にUVフィルターを配置して、紫外線をカットします。ここで96ウェルプレートの表面で0.5の太陽強度を得るようにランプの電力を調整し、参照太陽電池でランプを較正します。

この状態は、ランプに供給される218ワットの電力で達成されました。蓋を開けた状態で96ウェルプレートをランプの下に置き、細胞に60分間照射すると、照射後、1平方センチメートルあたり180ジュールの光量が得られます。HBSSを50マイクロリットルのDMEMに交換し、10%FBSを補充し、光線力学療法後、プレートをそれぞれの期間インキュベートします。

各期間の後、10マイクロリットルのMTTをウェルに追加して細胞の生存率を測定します。プレートを結晶上で4時間インキュベートして形成します。次に、50マイクロリットルの可溶化溶液をウェルに加え、プレートを6時間インキュベートします。

結晶のフォアを溶かすため。マイクロプレートリーダーで570ナノメートルの吸光度を記録し、ナノ粒子の固有の細胞毒性を測定することにより、細胞生存率を測定します。PDTを適用せずに96ウェルプレートを読み取り、ナノ粒子の取り込みを測定します。

PDT後に形成されたROSの検出とPDT後のアポトーシス壊死の検出 まず、顕微鏡とレーザーのランプをオンにします。 イメージングの30分前。固定細胞の入ったシャーレを顕微鏡のステージに置きます。

ナノ粒子から蛍光を収集します。RROS検出試薬プロピジウムが死んだ。ここでは、XIN five fitsiとDPIを重ね合わせた位相差画像と画像中の蛍光画像、J.Software、ナノ粒子を異なる細胞株とインキュベーションした後の代表的な結果を示します。

Ocar 3細胞株が最も高い取り込みを示し、次いで5、49、MDA MB 2、31となっています。TE 71 はナノ粒子の蛍光を示さない。これらの細胞株の細胞生存率測定値は、暗所に置いた場合の棒グラフで示されています。

どの細胞株でも、96時間までの細胞死はほとんどありません。ROS検出試薬で検出したROS形成を、カー3細胞株についてここに示します。このコントロールサンプルでは。

ナノ粒子や光量がないため、緑色の蛍光はありません。しかし、PDT直後にナノ粒子と光の両方を細胞に投与すると、ロス検出試薬からの明るい緑色の蛍光が見られます。DT後の細胞生存率は、ここではさまざまなナノ粒子用量の棒グラフで示されています。

生死二重染色実験の結果を以下に示します。ここでは、car 3細胞株のがハイライト線量で壊死し、低光線量では細胞がアポトーシス死を起こします。このビデオを見れば、光線力学療法に基づく疾患治療の応用のための複合導電性ポリマーナノ粒子の作製方法について十分に理解できるはずです。