نظام عضوي إنتاجية عالية لتوصيف الدواء حساسية خلايا المايلوما المتعددة الابتدائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الحساسية الكيميائية للخلايا الأولية للورم النقوي المتعدد لمجموعة من عوامل العلاج الكيميائي. يتم تحقيق ذلك عن طريق خلط خلايا الورم النقوي المتعددة المعزولة من نخاع العظم الطازج مع السدى والكولاجين المشتق من المريض. في الخطوة الثانية ، يتم زرع مزيج CEL على طبق متعدد الآبار.

ثم تتم معالجة الخلايا بعوامل العلاج الكيميائي ذات الأهمية ، ويتم نقل اللوحة إلى حاضنة مجهر المرحلة الآلي للتصوير المتسلسل للخلايا على مدار فترة حضانة مدتها 96 ساعة. في النهاية ، يمكن استخدام خوارزمية تحليل الصور الرقمية لإنشاء منحنيات الجدوى لكل دواء وتركيز. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على فحوصات الجدوى الحالية في أنه يمكن استخدامها لاختبار العديد من عوامل العلاج الكيميائي مقابل عينة مريض واحدة ، وأنه يمكن قياس صلاحية خلايا المريض طوليا على مدى عدة أيام دون الحاجة إلى فصل الخلايا عن السدى أو المصفوفة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الأورام المكونة للدم حيث يمكن استخدامها نظريا للتنبؤ بالاستجابة السريرية لأنظمة علاج كيميائي محددة. خطرت لنا فكرة هذا البروتوكول لأول مرة عندما أدركنا أن استبدال شرائح الموائع الدقيقة الأصلية بألواح متعددة الآبار سيقلل بشكل كبير من التكلفة والوقت اللازمين لإكمال التجربة. لتحضير الورم النقوي المتعدد الأولي ، تبدأ المزارع المشتركة للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظم مع ماصة متعددة القنوات بتعليق الخلايا عند ستة أضعاف التركيز النهائي في RPMI 1640.

متوسط بعد ذلك ، امزج 50 ميكرولترا من كل نوع خلية مع الكولاجين الطازج من النوع الأول إلى الحجم النهائي البالغ 300 ميكرولتر. ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع ثمانية ميكرولترات يدويا من مزيج مصفوفة الخلية في وسط كل بئر من 3 84. لوحة جيدة والطرد المركزي للوحة لتركيز جميع الخلايا على نفس المستوى البؤري.

بعد الغزل ، احتضن الألواح تحت ظروف زراعة الخلايا لمدة ساعة واحدة للسماح للهلام بالبلمرة. ثم أضف 80 ميكرولترا من وسط النمو المكملة إلى كل بئر واحتضان اللوحة طوال الليل للسماح للسدى بالالتصاق بقاع اللوحة. لتحضير المزارع المشتركة لسدى الورم النقوي المتعدد باستخدام ماصة روبوتية ، ابدأ بتعليق 300 ميكرولتر من خلايا الورم النقوي المتعدد الإيجابي CD 1 38 و 300 ميكرولتر من الخلايا اللحمية في RPMI 1640 ، متوسطة بستة أضعاف الكثافة النهائية المطلوبة كما هو موضح للتو.

ثم امزج كلا النوعين من الخلايا معا في أنبوب سعة 1.5 مليلتر يسمى CD 1 38 إيجابي ووضع الأنبوب في حاضنة زراعة الخلايا. بعد ذلك ، قم بتعليق 60 ميكرولترا من خط خلايا الورم النقوي المتعدد المناسب و 60 ميكرولترا من الخلايا اللحمية في RPMI 1640 ، متوسطة بستة أضعاف كثافة الرغبة النهائية وخلط كلا النوعين من الخلايا معا في أنبوب 1.5 مليلتر يسمى خط خلية الأنبوب الثاني هذا ويحتضن عند 37 درجة مئوية أيضا. على الماصة الروبوتية ، قم بتحميل ملف البرنامج النصي لتلقيح الخلية.

ثم ضع صندوق طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر في المحطة A ، ولوحة ميكروتيتر في المحطة B ومعقمة 3 84. لوحة جيدة في المحطة E من الروبوت. بعد ذلك ، امزج خليط الخلية الموجبة CD 1 38 مع أنبوب الوسط الممزوج مسبقا CD 1 38 المحضر حديثا ، وانقل 1.5 مل من محلول الخلية الناتج إلى البئر رقم واحد من لوحة الميكروتيتر.

ضع بقية الخلايا على الجليد وابدأ البرنامج. سيقوم الروبوت بزرع أول 176 بئرا من صفيحة البئر 384 ثم يتوقف مؤقتا. استخدم هذا الوقت لنقل الخلايا الموجبة المتبقية CD 1 38 إلى عدد اثنين من لوحة الميكروتيتر واستئناف البرنامج.

سيرى الروبوت الآئرا ال 144 المتبقية من اللوحة ويتوقف مرة أخرى. الآن امزج الخلايا من أنبوب خط الخلية مع أنبوب من الخلط المسبق لخط الخلية المحضر حديثا وانقل المحتويات إلى عدد ثلاثة من لوحة ميكروتيتر. ثم استأنف البرنامج مرة أخرى ، مما يسمح للروبوت بزرع البئر ال 64 المتبقية من لوحة البئر 3 84.

عندما يتم زرع البئر الأخير ، قم بتدوير الخلايا ونقل المزارع المشتركة إلى حاضنة زراعة الخلايا لبلمرة الكولاجين. بعد ساعة واحدة ، قم بتحميل البرنامج النصي لطبقة الوسائط على الروبوت وضع صندوق طرف ماصة سعة 120 ميكرولتر في المحطة A ، وهو خزان كاشف يحتوي على 31 مل من وسيط RPMI 1640 مكمل ببلازما مريض مصل الأبقار الجنيني والمضادات الحيوية في المحطة B ولوحة البئر CED 3 84 في المحطة E. ثم قم بتشغيل البرنامج. سينقل الروبوت 81 ميكرولترا من الوسط المكمل إلى كل بئر.

عند الانتهاء من الروبوت ، أعد الخلايا إلى الحاضنة للسماح للسدى بالالتصاق بالركيزة طوال الليل. لمعالجة الخلايا المصنفة بالدواء المعني ، قم أولا بتحميل البرنامج النصي للوحة الدواء لطبقة الوسائط في واجهة مستخدم الماصة الروبوتية. ثم ضع صندوقا بطرف ماصة سعة 120 ميكرولتر في المحطة A ، وهو خزان يحتوي على 21 مل من RPMI 1640 مكملا ببلازما المريض FPS والمضادات الحيوية في المحطة B ولوحة بئر فارغة 3 84 في المحطة E لتشغيل البرنامج ، ستضيف الماصة الروبوتية 30 ميكرولترا من الوسط إلى جميع الآبار.

لوحة البئر 3 84. ثم يتبع القالب عند 200 ميكرولتر من المخدرات بمعدل 20 ضعف التركيز الأقصى لكل بئر من صفيحة ميكروتيتر إلى عنصر التحكم. حسنا ، أضف متوسطا مكملا ببلازما المريض FPS والمضادات الحيوية.

ثم ضع صندوق طرف ماصة سعة 120 ميكرولتر في المحطة A ، ولوحة الميكروتيتر للأدوية في المحطة B و A 3 84 ، ولوحة البئر المتوسطة في المحطة C تقوم بتحميل برنامج لوحة الدواء. ستقوم الماصة الروبوتية بإنشاء تخفيف تسلسلي من واحد إلى ثلاثة كما هو موضح في هذا الشكل. الآن ضع صندوقا جديدا لطرف ماصة سعة 120 ميكرولتر في المحطة A ، ولوحة البئر 3 84 من الدواء المخفف في المحطة B ولوحة البئر 3 84 من الخلايا المصنفة في المحطة C وقم بتشغيل برنامج إضافة الدواء.

ستنقل الماصة الروبوتية ثمانية ميكرولترات من الدواء من كل بئر من صفيحة الدواء إلى نظيرتها في لوحة الخلية. بعد معالجة البئر الأخير ، انقل لوحة الخلية على الفور إلى حاضنة المجهر الرقمي. ثم لتصوير الخلايا ، قم بتنظيف الجزء الداخلي من الحاضنة التي توضع على الطاولة بمنديل مبلل من الإيثانول ، وقم بتبديل غطاء اللوحة بعناية بغطاء الحاضنة.

بعد ذلك، اتبع خطوات البرنامج لإضافة المعالم للمناطق ذات الأهمية التي سيتم تصويرها على التوالي أثناء التجربة. أخيرا ، باستخدام هدف تكبير خمسة أو 10 مرات ، اجعل الخلايا في التركيز حتى تظهر خلايا الورم النقوي المتعددة كأقراص ساطعة محاطة بحلقة داكنة والخلايا اللحمية بالكاد مرئية. في هذه التجربة ، كانت خلايا الورم النقوي المتعدد الحية ملونة زائفة باللون الأخضر مع ملاحظة إشارة خضراء قليلة أو معدومة في الخلايا البطانية اللحمية والوريد السري البشري في نهاية التجربة بأعلى تركيز للدواء عندما ماتت جميع خلايا الورم النقوي المتعدد.

ثم تم استخدام برنامج الروبوت للتخلص من الفقدان التدريجي للصلاحية الناتج عن التعرض لتركيزات الأدوية المختلفة بمرور الوقت. من المهم مراقبة جميع الآبار المصنفة بعناية قبل البدء في عملية التصوير لأن القطع الأثرية قد تضلل برنامج تحليل الصور وتؤدي إلى نتائج خاطئة. على سبيل المثال ، هنا تظهر نتيجة الكثافة المفرطة للخلايا اللحمية أو الكثير من الوقت بين التربسين والبذر مما يؤدي إلى تكوين تكتل الخلايا كما هو موضح في هذه الصورة.

إذا تم زرع خطوط الخلايا بكثافتين عاليين ، فإنها ستشكل مستعمرات أثناء تكرارها مما يقلل من دقة خوارزمية تحليل الصور الرقمية حيث يصبح من الصعب بشكل متزايد تمييز خلية واحدة عن الأخرى هنا تم زرع عدد قليل جدا من خلايا الورم النقوي المتعددة عندما يكون عدد خلايا الورم النقوي المتعدد التي تم الحصول عليها من نفطة نخاع العظم أقل من 500 ، 000. من الضروري تحديد الحجم الميت للأنبوب المستخدم قبل بذر الخلايا وإدراج هذا الحجم في حسابات التخفيف. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بالوسط الممزوج مسبقا الذي يحتوي على الكولاجين على الجليد لمنع البلمرة قبل أن تصبح الخلايا جاهزة. كما ساعد في استكشاف كيف يمكن لعدم تجانس الحساسية الكيميائية لعبء الورم أن يحدد عمق ومدة استجابة المريض.