Name: Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Aprenda a usar a microrreologia de rastreamento de partículas para medir propriedades viscoelásticas de biofilmes bacterianos in situ. Esta técnica não destrutiva oferece alta resolução espacial para estudar a mecânica da matriz.

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Esta investigação é apoiada pela Fundação Nacional de Pesquisa e Ministério da Educação Singapura no âmbito do seu Centro de Pesquisa do Programa de Excelência, as ajudas à instalação (M4330002.C70) da Universidade Tecnológica de Nanyang, e ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) do Ministério da Educação, Cingapura. Os autores agradecem Joey Yam Kuok Hoong para participar na manifestação deste protocolo.

1. biofilme Cultivo <ol><li> Preparação de Estirpes Bacterianas <ol><li> 1 dia antes do cultivo biofilme, preparar culturas de bactérias planctónicas inoculando 2 ml de meio de crescimento adequado a partir da cultura bacteriana congelado. Use meio de Luria-Caldo (10 g L -1 de NaCl, 10 g L -1 extrato de levedura e 10 g L -1 triptona) para mucoid P. aeruginosa e as suas pel Δ e Δ psl mutantes defeituosos. Incubar durante a noite a 200 rpm agitação condições 37 ° C e. Dilui-se as culturas durante a noite para uma DO 600 de 0,40 usando um espectrofotómetro. </li><li> Montar configuração da célula de fluxo, o que tem sido descrito anteriormente 14, de preferência em uma estação móvel ou carro que pode ser levado para a sala de microscópio para imagiologia da célula de fluxo, sem desmontagem. </li><li> Prepare meio de crescimento estéril em 2 L ou L 5 frascos para cada célula de fluxo. Use meio mínimo M9 (48 mM de Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM de NH4CI, NaCl 9 mM, 2 mM de MgSO4, e 0,1 mM de CaCl2) suplementado com 0,04% de glucose (p / v) e 0,2% (peso / vol) de casaminoácidos) para P. aeruginosa fluir biofilmes celulares. </li><li> Aliquota microesferas fluorescentes em tubos de microcentrífuga e girar para baixo em H 2 O esterilizada durante 5 min numa centrífuga a 9,391.2 g. Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de meio de crescimento para remover azida de sódio (desinfectante) antes da adição ao meio de crescimento em G 2 ou 5 frascos de meio L. NOTA: Os tamanhos diferentes de microesferas vir em diferentes concentrações e deve ser diluída de acordo com as instruções. Por exemplo, dispersar 120 ul de microesferas de 1,0 um de diâmetro, 15 ul de microesferas de 0,5 um de diâmetro e 0,96 ul de microesferas de 0,2 um de diâmetro em 2 L de meio de crescimento para dar 2,18 x 10 6 ml -1 microesferas para cada tamanho de partícula. </li><li> Anexar meio garrafa para upstresma de célula de fluxo e permitir que o meio de crescimento a fluir através de instalação inteira. Pare o fluxo e injectar culturas durante a noite diluídas em câmaras de célula de fluxo. Permitir que as bactérias para anexar o substrato lamela durante 1 h antes de continuar o fluxo de meio de crescimento a uma taxa de fluxo de cerca de 5,5 x 10 -3 m s-1, ou 8 rpm com uma bomba peristáltica. NOTA: Os biofilmes são normalmente cultivadas à temperatura ambiente (25 ° C) durante 3-7 dias. </li><li> Alternativamente, para a configuração cultura estática, dilui-se culturas de uma noite de 100 vezes em tubos de microcentrífuga adicionando 10 ul de cultura durante a noite a 1 ml de meio de crescimento com partículas. Aumentar a concentração de partículas no meio de crescimento para cultura estática de cerca de 500 vezes em comparação com a utilizada para biofilmes de fluxo (por exemplo, lavar e ressuspender 600 ul de 1,0 uM esferas de diâmetro em 10 ml de meio de crescimento) como biofilmes de células de fluxo estão constantemente reabastecido com partículas, mas as culturas não são estáticas. <ol><li> Adicionar 2001; l de cultura durante a noite diluiu-se com partículas para as câmaras de 8 lâminas bem. Incubar a 37 ° C em condições estáticas. Os biofilmes são normalmente cultivadas para 1 dia. Substitua meio de crescimento gasto diário com meio de crescimento fresco com partículas se biofilme é cultivado por mais de 1 dia. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Microscopia <ol><li> No dia 3 e 5, desligue o fluxo de bomba peristáltica e trazer configuração de célula de fluxo para a sala de microscopia. Tubulação braçadeira perto da entrada e saída das câmaras de célula de fluxo para evitar a deriva (a causa do erro sistemático por mudanças no ambiente de fluxo). Coloque a célula de fluxo para o estágio de microscópio de um microscópio vertical. NOTA: Use um microscópio invertido para a imagem latente de micropoços. </li><li> Use microscopia fluorescente com 40X objetivo óleo para gravar vídeos de microesfera de movimento embutidos no biofilme em vários locais (microcolônias e camadas indiferenciadas plana) e em diferentes dias (dia 3 e 5) parainvestigações temporais e espaciais. Gravar vídeos curtos com maior taxa de quadros para investigar os eventos que ocorrem dentro de escalas de tempo curto (por exemplo, 1,5-3 mínimo de vídeos na taxa de quadros de 25-50 frames por segundo para uma dinâmica rápida), e mais vídeos com menor taxa de quadros para investigar eventos durante mais tempo escalas (por exemplo, 15-30 mínimo de vídeos na taxa de quadros de 2,5-5 frames / seg para uma dinâmica mais lentas). NOTA: Um vídeo normalmente contém partículas de 5-10, e é tipicamente de 1,0-2,5 GB no tamanho do arquivo. Microcolônias maiores podem conter mais partículas. Leve 5-10 vídeos para cada categoria (por exemplo, 10/05 vídeos de diferentes microcolônias e de diferentes locais em camadas planas indiferenciados). O biofilme tem uma arquitectura heterogénea que pode consistir de microcolónias, canais, cavidades e indiferenciadas camadas planas. </li><li> Salvar vídeos em formato apropriado que podem ser lidos por Fiji / ImageJ (por exemplo CZI, tif). </li><li> Confira vídeos de tração, percorrendo vid acabadoEO e observando-se que as partículas não se movem na mesma direcção simultaneamente. A deriva pode ser causado pelo movimento Z-fase, as correntes na célula de fluxo, o desequilíbrio de mesa anti-vibração, pressão de ar ou mudanças de temperatura. Menor correta deriva usando técnicas de pós-processamento normalmente fornecidos com o software de microscópio. Descartar nenhum vídeo em que deriva não podem ser corrigidos. Grave os seguintes parâmetros, que são necessários durante Particle Analysis Tracking: resolução (px / um), número de quadros, Duração. </li><li> Remover célula de fluxo de platina do microscópio e reiniciar a bomba peristáltica continuar a cultivar o biofilme. </li></ol> 3. Análise de Rastreamento de Partículas <ol><li> Obter trajetórias de partículas que usam o plug-in Trackmate em software de fonte aberta (ImageJ). Baixe Fiji em <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji.</a> Abra o vídeo com Fiji e no menu Plugins, selecione Rastreamento e Trackmate. </li><li> Verifique ou ajustar as definições em the janela sugerindo ajustes de calibração iniciais para combinar os parâmetros de vídeo como registrado no passo 2.4. </li><li> Detectar partículas no Trackmate usando ImageJ. <ol><li> Selecione &#39;detector Log&#39;, diâmetro das partículas de entrada e valor limite (por exemplo, 1000). Percorra o vídeo enquanto clicando no botão &#39;Preview&#39; para verificar se os círculos roxos siga as partículas ao longo do vídeo. Ajuste os valores de diâmetro e de limite, conforme necessário: aumentar o valor limite se círculos roxos aparecer no espaço vazio. Reduzir o valor limite se forem detectadas partículas não o suficiente. Clique no botão ao lado para completar a detecção de partículas. </li><li> Clique no botão ao lado quando apresentado com a opção de adicionar ou remover as partículas detectadas no &#39;limiar Inicial&#39;, &#39;Selecione uma exibição&#39; e &#39;Selecione um filtro&#39; janelas para continuar sem ajuste se a detecção de partículas inicial foi satisfatório. </li><li> Selecione &#39;rastreador simples LAP&#39; na optina barra de &#39;Selecione um método rastreador &quot;janela como partículas raramente mover fora de foco no biofilme e são facilmente controladas. Use os valores max distância ligando sugerido ou baixo e abertura-fechamento, e clique em Avançar. </li><li> Verifique se rastreamento de partículas é satisfatória, percorrendo o vídeo para ver que as partículas de seguir as trilhas traçadas por Trackmate, e que não existem faixas indesejadas ou ausentes. Ir as várias etapas de filtragem. Ir para a última janela &quot;Selecione uma ação &#39;. Selecione &#39;faixas de exportação para arquivo xml&#39; a partir do menu drop-down e clique em &quot;Executar&quot;. Escolha uma pasta para salvar as faixas. NOTA: Existem vários programas disponíveis no domínio público para a análise de trajetórias de partículas e uso de microrheology. msdanalyzer e TrackArt são exemplos de programas de análise de rastreamento de partículas que são executados no ambiente Matlab. </li></ol></li><li> Prepare Matlab para importar as trajetórias de partículas nos arquivos XML, selecionando no menu deArquivo Matlab&gt; Set Path ... e adicione a pasta disponíveis os scripts com o pacote de Fiji. </li><li> Para analisar as trajetórias de partículas com msdanalyzer, baixar o link para o arquivo zip ou o arquivo tar.gz at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> Extraia a pastamsdanalyzer 15 e soltá-lo em uma pasta que pertence ao caminho Matlab (por exemplo C: Documents and Settings &lt;usuário&gt; Meus Documentos Matlab). Comece Matlab e iniciar o analisador de digitação: ma = msdanalyzer (2, &#39;um&#39;, &#39;s&#39;) onde hum e sec são as unidades de tempo e espaço físicos no vídeo. <ol><li> Importe as trajetórias de partículas, digitando: [faixas, md] = importTrackMateTracks (&#39;FileName.xml&#39;, &#39;Clipz&#39;;, &#39;Scalet&#39;) ma = ma.addAll (faixas); onde &#39;Clipz&#39; remove a dimensão z para um vídeo 2D, e &#39;Scalet&#39;. </li><li> Traçar as trajetórias Onto gráfico usando: ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> Calcule os LME das partículas usando: ma = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> Traçar as perturbações músculo-esqueléticas de cada partícula: figura ma.plotMSD </li><li> Combinar trajetórias de partículas de outros vídeos do mesmo categery (por exemplo, partículas incorporadas no tipo selvagem microcolônias no dia 3), repetindo 3.5.1.1 a 3.5.1.4). </li><li> Traçar o conjunto médio ou a média sobre todas as curvas: ma.plotMeanMSD Alterar o Y e eixo-x de linear para escala logarítmica. Às vezes longas lag, as curvas MSD tornar-se barulhento devido a estatísticas insuficientes em prazos mais longos. As curvas MSD também pode subir abruptamente devido a erro dinâmico. Estas regiões da curva pode ser removida usando a ferramenta pincelpara selecionar o final da curva e da selecção de &quot;Escovar &#39;&gt;&#39; Remover unbrushed &#39;no menu Ferramentas. </li></ol></li><li> Baixe Ezyfit em <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> e adicionar Ezyfit para uma pasta pertencente ao caminho Matlab (por exemplo C: Documents and Settings &lt;usuário&gt; Meus Documentos Matlab). Instale o menu Ezyfit digitando em Matlab espaço de trabalho efmenu instalar. Reinicie MATLAB com cardápio Ezyfit na janela de figura. Ajustar as curvas MSD para a lei de potência, selecionando no menu Ezyfit &#39;Show Fit&#39;&gt; &#39;Power&#39;&gt; &#39;a * x ^ n&#39; eram n é o expoente α diffusive estimado. NOTA: msdanalyzer requer o ajuste de curva Toolbox em Matlab para ajuste de curvas de MSD. Ezyfit é uma alternativa e software livre que pode executar ajuste de curva. </li><li> Limpar trajetórias de partículas atuais e LME para calcular os novos LME partículas em outros locais ou tempo: Claro </li&gt; <li> Após o cálculo de várias curvas médias MSD de partículas no meio (controle), e microcolônias e áreas indiferenciadas de diversas estirpes, copie e cole as curvas em um gráfico para comparação. Rigidez da amostra e reticulação aumento com valores mais baixos MSD. Curvas planas têm α inferiores e amostra é mais elástica do que curvas mais íngremes com maior α. </li><li> Selecione a curva e vá em &quot;Ferramentas&quot; olhar para as estatísticas de dados, como a mediana e intervalo. A MSD da pérola é proporcional à fluência conformidade, J (t) do material em que o grânulo é incorporado de acordo com a relação, <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> onde J = conformidade fluência, d = diâmetro da partícula, B k = constante de Boltzmann, T = temperatura e t = tempo. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Microrheology é uma ferramenta útil para medições reológicas locais em sistemas heterogêneos, como biofilmes microbianos. É uma técnica não destrutiva, o que permite o acompanhamento em tempo real das modificações reológicas dentro da mesma amostra biológica sobre vários pontos de tempo. Neste protocolo, de rastreamento de partículas microrheology foi aplicada a Pel e mutantes de exopolissacarídeo Psl a fim de investigar como eles afetam a elasticidade e reticulação eficaz da matriz do biofilme. Psl fa...

A maioria das células bacterianas são capazes de empregar tanto planctônicas (de vida livre) e (sésseis) modos ligado à superfície de crescimento 1. No modo ligado à superfície de crescimento, as células bacterianas e secretar encerrar-se em grandes quantidades de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) para formar biofilmes. O EPS é constituído principalmente por proteínas, exopolissacarídeo, ADN extracelular e é essencial para a formação de biofilme 2. Ele serve como um andaime física através da qual as bactérias podem ser utilizadas para diferenciar espacialmente e protege as bactérias de condições ambientais prejudiciais e as respostas do hospedeiro. Diferentes componentes de EPS têm papéis distintos na formação de biofilme 3 e alterações na expressão de componentes EPS pode remodelar drasticamente estruturas biofilme 4. Componentes EPS também pode funcionar como moléculas sinalizadoras 5, e estudos recentes tem mostrado certos componentes EPS interagindo com células microbianas para orientar suas migração e biofilme differentiation 6-8. A investigação sobre o EPS tem muito avançado com base nas análises morfológicas dos biofilmes produzidos por mutantes defeituosos em um componente específico do EPS 9,10. Além disso, o EPS é geralmente caracterizado na macro-escala (caracterização granel) 11. Morfológica analisa no entanto pode faltar detalhe caracterização quantitativa e grandes quantidades, o que devolve valores médios, perde o detalhe de que existe dentro da heterogeneidade do biofilme. Existe agora uma tendência crescente para avançar para caracterização em tempo real das propriedades mecânicas do EPS no micro-escala. Este protocolo demonstra como partícula-tracking microrheology é capaz de determinar os efeitos espaço-temporais de componentes da matriz Pel e exopolissacarídeos Psl sobre a viscoelasticidade e eficaz de reticulação de Pseudomonas aeruginosa 4 biofilmes. Microrheology passivo é um rh simples e baratoeology método que fornece a maior velocidade de amostragem microrheological espacial de um material à data 12,13. Em microrheology passiva, esferas de sondas são colocados na amostra e o seu movimento Browniano, impulsionado por energias térmica (K) B T é seguido por microscopia de vídeo. Diversas partículas podem ser monitoradas simultaneamente, e as coordenadas dependentes do tempo das partículas seguem um passeio aleatório convencional. Portanto, em média, as partículas permanecem na mesma posição. No entanto, o desvio padrão dos deslocamentos ou o deslocamento quadrático médio (MSD) das partículas, não é zero. Uma vez que o fluxo de fluidos viscosos, a partícula MSD num fluido viscoso cresce linearmente à medida que o tempo avança. Em contraste, a ligação cruzada polimérico encontrado em viscoelástico ou substâncias elásticas para ajudar a resistir a fluir, e as partículas tornam-se limitada no seu deslocamento, levando a planaltos na curva MSD (Figura 1A). Esta observação segue a relação MSDαt <saté&gt; α, onde α é o expoente difusivo que está relacionada proporção de contribuições elásticas e viscosas da substância. Para as partículas que se deslocam em fluidos viscosos a = 1, em substâncias viscoelásticas 0 &lt;α &lt;1, e em substâncias elásticas α = 0. A MSD também pode ser utilizado para calcular a conformidade fluência, que é a tendência do material para deformar permanentemente sobre tempo e estima quão facilmente um spread materiais. O tamanho, densidade e química da superfície da partícula são importantes para a aplicação correcta do experimento microrheological e são escolhidos com respeito ao sistema estudado (neste caso, os polímeros da matriz do biofilme, ver Figura 1B). Em primeiro lugar, a partícula mede a reologia da substância com as estruturas que são muito menores do que a própria partícula. Se as estruturas da substância são de dimensão semelhante à das partículas, o movimento do partigo é perturbado pela forma e orientação das estruturas individuais. No entanto, se as estruturas circundantes da partícula são muito menores, este efeito é pequena e média para fora, apresentando um ambiente homogéneo para a partícula (Figura 1B). Em segundo lugar, a densidade das partículas deve ser semelhante ao meio (1,05 g ml -1 de meios à base de água) de tal modo que a sedimentação é evitada e as forças de inércia são insignificantes. A maioria das partículas de poliestireno com treliças cumpram os critérios acima. Idealmente, a partícula não interage com os polímeros da matriz do biofilme como a interpretação reológico de partícula MSD só é válida se o movimento é aleatório, conduzido por energia térmica e de colisão com estruturas de substância. Isto pode ser observado através da verificação se a sonda de partículas tende a ligar-se ou saltar para fora da superfície de um biofilme de pré-adulto. No entanto, apesar da falta de atracção para o biofilme, as partículas devem ser capazes de ser incorporados na matriz.Além disso, a heterogeneidade físico-químicas do biofilme pode resultar em diferentes partículas sendo mais apropriados como sondas em diferentes regiões do biofilme. Assim, as partículas de diferentes tamanhos e química de superfície deve ser aplicado para o biofilme. Como tal, a partícula MSD é capaz de fornecer informações úteis sobre como os diferentes componentes contribuem para a reologia e divulgação do biofilme. Além disso, a utilização de diferentes sondas permite a obtenção de informação sobre a heterogeneidade espacial físico-química do biofilme. Este método pode ser utilizado para testar o efeito do tratamento antimicrobiano sobre as propriedades mecânicas do biofilme, ou aplicado a biofilmes espécies mistas para investigar como as propriedades mecânicas do biofilme são alteradas de introdução de uma outra espécie. Partículas perturbações músculo-esqueléticas pode também ser útil para caracterizar a dispersão do biofilme. Tais estudos seriam úteis em nosso entendimento de biofilmes, melhorando potencialmente tratamentos biofilme umnd engenharia de biofilmes para atividades úteis.

<table><tbody><tr><td>Fluorspheres</td><td>Invitrogen</td><td>F-8821</td><td>1.0 &amp;#956;m red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager M1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Epifluorescent Microscope</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td>Peristaltic pump</td></tr><tr><td>Flow Cell Chambers</td><td>Technical University of Denmark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bubble Trap</td><td>Technical University of Denmark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone Tubing</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>3 mm outer diameter, 1&amp;nbsp;mm inner diameter</td></tr><tr><td>Clear polypropylene plastic connectors&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06365-83</td><td>1/16 in. (1.588 mm)</td></tr><tr><td>Binder Clips</td><td></td><td></td><td>To clamp tubing</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thermo Scientific&amp;trade; Nunc&amp;trade;</td><td>50 x 24 mm</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 3 ml</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 &amp;nbsp;G Needle</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &amp;nbsp;L Storage/Media Bottles</td><td>VWR&amp;reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trolley</td><td></td><td></td><td>To hold biofilm setup</td></tr></tbody></table>

in situ mapping of the mechanical properties of biofilms by particle-tracking microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

As propriedades viscoelásticas locais do biofilme em diferentes regiões do biofilme, que inclui os espaços vazios (médias acima do biofilme), planícies (camada plana de células indiferenciadas) e microcolônias (ver etiquetas na Figura 2A) foram investigados. As alterações temporais em propriedades viscoelásticas do biofilme durante a maturação dos dias 3 a 5 também foram determinadas. A MSD das partículas em espaços vazios foi usada como um controlo e comparável ao MSD de partículas em ...

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In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

The overall goal of this methodology is to show how to measure the real logical properties within the micro domains of heterogeneous flow cell and static biofilms. This method can help answer key questions on ology in biofilm field, such as how specific metrics component, different species or compound affect biofilm neurology and test its response to physical force such as shere. This is a non-destructive technique with high spatial resolution, and it can be conducted with equipment standard to biological laboratories.After preparing overnight bacterial cultures and supplies and medium for flow cell setup, according to the text protocol, aliquot fluorescent microspheres in sterile water into micro centrifuge tubes to remove the sodium azide, spin down the tubes for five minutes under a sterile environment such as a flow hood, remove the supernat and use one milliliter of growth medium to re suspend the microspheres. Then add microspheres to the rest of the growth media for flow cell culture. Set up flow cell culture according to the text protocol for a static culture setup for biofilms grown in micro well chambers dilute overnight cultures 100 fold in micro centrifuge tubes by addi

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Fonte: Kurz, D. L., et al. Plataforma microfluídica para estudar bioentupimento em meios porosos. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra o uso de um dispositivo microfluídico para estudar a formação de biofilmes. Uma suspensão bacteriana é introduzida no microcanal, seguida de incubação para permitir o desenvolvimento do biofilme. O fluxo é então retomado, e o monitoramento de pressão junto com imagens é usado para detectar formação de biofilme e obstrução dos poros ao longo do tempo.

Um dispositivo microfluídico para imagem em tempo real e acompanhamento de pressão durante a formação do biofilme

Este documento mostra uma metodologia original baseado na actuação remota de partículas magnéticas semeadas num biofilme bacteriano e o desenvolvimento de uma pinça magnéticos dedicados para medir in situ as propriedades mecânicas locais da matéria viva complexo construído por micro-organismos nas interfaces.

Atuação Remoto magnética de micrométricas para Sondas<em&gt; In situ</em&gt; Mapping 3D de bactérias biofilme Propriedades Físicas

-Tracking microrheology partícula pode ser usada para quantificar de forma não destrutiva e espacialmente mapear as alterações nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos de tumor em 3D.

Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

Este artigo apresenta um método para o cultivo de um biofilme para em situ íon secundário de tempo-de-voo espectrometria de massa para mapeamento químico em seu estado hidratado, habilitado por um reator microfluídicos, sistema para análise na Interface líquido do vácuo. A Shewanella oneidensis MR-1 com proteína de fluorescência verde foi usado como um modelo.

In Situ Caracterização de Shewanella oneidensis MR1 biofilmes por SALVI e ToF-SIMS

A falta de ferramentas para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo impede Validando seus papéis durante o desenvolvimento. Utilizamos microscopia de força atômica (AFM) e acompanhamento de nanopartículas para quantificar as características mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Esses métodos são confiáveis e amplamente aplicável, evitando intervenções intrusivas.

AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema

Demonstramos a fabricação e o uso de um dispositivo microfluidic que permite múltiplas partículas microrheology medições para estudar os efeitos reológicos de transições de fase repetidas em matéria mole de rastreamento.

Combinando microfluídica e Microrheology para determinar as propriedades reológicas de matéria mole durante as transições de fase repetidas

Os biofilmes microbianos formam arquiteturas complexas em interfases e se desenvolvem em padrões espaciais altamente dependentes de escala. Aqui, apresentamos um sistema experimental (Hard-e software) para a aquisição automatizada de conjuntos de dados de tomografia de coerência óptica 3D (OCT). Este conjunto de ferramentas permite a caracterização não invasiva e em várias escalas da morfogênese do biofilme no espaço e no tempo.

Tomografia de coerência óptica 3D automatizada para elucidar a morfogênese do biofilme sobre grandes escalas espaciais

O protocolo apresenta um fluxo de trabalho completo para experimentos de nanoindentação de materiais moles, incluindo hidrogéis e células. Primeiro, as etapas experimentais para adquirir dados de espectroscopia de força são detalhadas; em seguida, a análise de tais dados é detalhada através de um software Python de código aberto recém-desenvolvido, que é gratuito para download no GitHub.

Fluxo de trabalho experimental e de análise de dados para nanoindentação de matéria mole

Este trabalho destaca a eficácia da técnica de elastografia de coerência óptica (OCE) na caracterização rápida e não destrutiva das propriedades elásticas do biofilme. Nós elucidamos procedimentos críticos de implementação de OCE para medições precisas e apresentamos os valores do módulo de Young para dois biofilmes granulares.

Quantificação das Propriedades Elásticas de Biofilmes Ambientais utilizando Elastografia de Coerência Óptica

Este artigo descreve os procedimentos básicos para a realização de experimentos de mapeamento óptico no coração de coelho Langendorff-perfundidos usando o sistema de imagem panorâmica, ea modalidade de imagem dupla (tensão e cálcio).

Multiparamétrico Mapping Optical do Coração Coelho Langendorff-perfundidos

Aprenda a usar a microrreologia de rastreamento de partículas para medir propriedades viscoelásticas de biofilmes bacterianos in situ. Esta técnica não destrutiva oferece alta resolução espacial para estudar a mecânica da matriz.

Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

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