הזרקת intracerebroventricular של פפטידים עמילואיד-β בעכברים נורמליים כדי לגרום בחריפות גירעונות אלצהיימר דמוי קוגניטיבית
March 16th, 2016
העמילואיד-β (Aβ) -injected במודל חיה מאפשרת לממשל של כמות לבין מינים מוגדרים של שברי Aβ ומפחית הבדלים אינדיבידואליים בתוך כל קבוצת לימוד. פרוטוקול זה מתאר את intracerebroventricular (ICV) הזרקה של Aβ ללא מכשירים stereotactic, המאפשרת הפקה של ליקויים התנהגותיים אלצהיימר דמויי בעכברים נורמליים.
המטרה הכוללת של הליך כירורגי זה היא לבצע הזרקה תוך מוחית של עמילואיד בטא ללא מכשירים סטריאוטקטיים, ולגרום באופן חריף להפרעות התנהגות דמויות אלצהיימר בעכברים רגילים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון גילוי תרופות למחלת אלצהיימר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לבצע הזרקה ישירה של בטא A לאזור התוך מוחי של העכברים ללא עזרה של מכשירים סטריאוטקטיים, והיא מאפשרת לנו לחקות חריגות התנהגות דמויות אלצהיימר בעכברים מבלי לחכות לתהליך ההזדקנות.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחון של מחלת אלצהיימר, מכיוון שניתן להשתמש בה כדי לחקור את הפתולוגיה במורד הזרם של עמילואיד בטא, ולסנן מועמדים לתרופות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, מכיוון שמציאת המיקום המדויק של ברגמה על גולגולת של בעל חיים עשויה להיות קשה. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו A-beta מילי-מולרית אחת עם DMSO.
לאחר מכן, יש לדלל אותו פי עשרה ב-PBS. לאחר מכן, הכינו תמיסת PBS המכילה 10% DMSO ככלי להזרקת ICV. לאחר מכן, עטפו את המיקרו-מזרק במחט נירוסטה בגודל 26 באמצעות רצועות Parafilm על מנת להתאים את אורך המחט להזרקה מבוקרת עומק.
עטפו בצפיפות את המזרק מספר פעמים כדי שהפרפילם לא יידחס במהלך החדרת המחט, ואורך המחט יישאר קבוע. לאחר מכן, חותכים את שכבות רצועות הפרפילם כדי להתאים את אורך המחט ל-3.8 מילימטרים בין קצה המחט לפרפילם. לאחר מכן, שטפו את המזרק פעמיים עם אתנול 70%.
לאחר מכן יש לשטוף את המזרק במים מזוקקים. יבש אותו לחלוטין במכסה אדים למשך 30 דקות לפחות, והשאיר את המזרק הנקי מתחת לאור UV למשך 20 דקות נוספות לפני ההזרקה. בשלב זה, הניחו עכבר מורדם בן שבעה שבועות על מחצלת חמה.
לאחר מכן, יש למרוח טיפות PBS סטריליות או משחה על שתי העיניים כדי למנוע יובש בקרנית במהלך ההליך. לאחר מכן, אשר הרדמה מספקת על ידי הערכת רפלקס הנסיגה של צביטת הבוהן. לאחר מכן, הכינו שתי מראות עם קווים אנכיים מרובים המצוירים על המשטחים כדי לספק הפניות להזרקה הניצבת של המזרק.
הניחו מראה אחת ממש ליד גוף העכבר, ואת השנייה מול הראש. שמור על M1 מקביל לקו האמצע הדמיוני בין שתי עיני העכבר וסדר את M2 בניצב ל-M1, כך ששני המישורים יוצרים זווית של 90 מעלות. לאחר מכן, רססו אתנול 70% על מצח העכבר, ושפשפו אותו עם צמר גפן יבש.
כדי לאתר את הברגמה, הניחו את האגודל והאצבע המורה ישירות מעל העיניים ולחצו מעט על המצח כלפי מטה עד ששתי העיניים בולטות. במקביל, גרור את עור המצח לאחור על מנת למזער את תנועת הגולגולת מתחתיו. אתר את מקום ההזרקה בעזרת סרט חייט בעומק של 2.4 מילימטרים מתחת לגולגולת.
מלאו את המזרק ב-10 מיקרוליטר של תמיסת A-beta או רכב. הנח את המזרק כך שיהיה בניצב למישור אתר ההזרקה. לאחר מכן, יישר את התמונות המשתקפות של המזרק בשתי המראות עם הקווים המצוירים על המראות.
התחל להחדיר את המחט עד שעטיפת הפרפילם נוגעת בעור. החזיקו את המזרק ביד אחת, והזריקו חמישה מיקרוליטרים של תמיסת ה-A-beta או הרכב ביד השנייה, לאט במשך חמש שניות ללא הפסקה, וודאו שהמזרק נשאר בניצב לכל אורכו. לאחר השלמת ההזרקה, המתן שלוש עד חמש שניות לפני הסרת המזרק.
הנח את האגודל והאצבע המורה בחזרה על הראש, והחזק אותו כלפי מטה כדי למנוע מהגולגולת תנועות מיותרות. ואז הסר את המזרק מבלי להטות. לאחר מכן, הנח את העכבר על כרית חמה להתאוששות.
כדי לוודא אם A-beta הוזרק לאזור ה-ICV היעד, בדוק את עקבות החדרת המחט לרקמת המוח כדי לראות אם היא הגיעה לאחד החדרים. אם ההזרקה לא הצליחה, אל תכלול את הנתונים של אותו נבדק מניתוח תוצאות הניסוי. בניסוי זה, נעשה שימוש בפפטיד A-beta באורך מלא של 42 חומצות אמינו לייצור תערובת של מונומרים A beta, אוליגומרים וסיבים.
באמצעות שלב המונומריזציה המושרה על ידי HFIP, התקבלו מונומרים הומוגניים יחסית. לאחר הדגירה של שבעה ימים, פותחו גדלים מגוונים של אגרגטים A-beta, שבהם טרימרים וטטרמרים היו המינים הדומיננטיים בין הצורות האוליגומריות של A-beta. במחקר זה, זיכרון עבודה מרחבי הוערך בעכברים שהוזרקו A-beta במבחן מבוך Y, שבו נרשמו רצף בחירות הזרוע ומספר כניסות הזרוע הכולל בזמן שכל עכבר הורשה לחקור בחופשיות את המבוך.
קבוצת העכברים שהוזרקו A-beta הראתה שיעורי חילופין נמוכים משמעותית, מה שמעיד על התפתחות של ליקויים קוגניטיביים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 20 דקות, כולל הליכי הרדמה, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליכים אלה, חשוב לזכור להפוך את המחט לניצב למישור ההזרקה.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום גילוי תרופות למחלת אלצהיימר לחקור סינון in vivo של מועמדים לתרופות במודלים הנגישים הללו של מכרסמי אלצהיימר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע הזרקה תוך מוחית ללא מכשירים סטריאוטקטיים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מתאר את ההזרקה התוך-מוחית של חלבון בטא עמילואיד (Aβ) בעכברים רגילים ללא שימוש בכלים סטריאוטקטיים. שיטה זו מאפשרת אינדוקציה חריפה של חריגות התנהגותיות דמויות אלצהיימר, ומסייעת במחקר בנוירוביולוגיה ובגילוי תרופות למחלת אלצהיימר.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי העצב
- נוירוביולוגיה
- מחקר על מחלת אלצהיימר
רקע
- מודל החיה שמוזרק בו Aβ מפחית את ההבדלים האישיים בקבוצות המחקר.
- שיטה זו מאפשרת הזרקה ישירה לאזור התוך-מוחי.
- היא מדמה התנהגות דמוית אלצהיימר ללא צורך בהמתנה להזדקנות.
- מציאת המיקום המדויק של הברגמה יכולה להיות מאתגרת עבור חדשים בתחום.
מטרת המחקר
- לאינדוקציה של חריגות התנהגותיות דמויות אלצהיימר בעכברים רגילים.
- לחקור את הפתולוגיה העוקבת של חלבון בטא עמילואיד.
- לסנן מועמדים פוטנציאליים לתרופות למחלת אלצהיימר.
שיטות ששימשו
- הזרקה תוך-מוחית של Aβ.
- הכנת Aβ אחד מילמולרי עם DMSO.
- הערכה התנהגותית של החריגות שהושרו.
- הערכה של השלכות גילוי תרופות.
תוצאות עיקריות
- אינדוקציה מוצלחת של התנהגות דמוית אלצהיימר בעכברים.
- הוכחת היתכנות השיטה ללא כלים סטריאוטקטיים.
- השגת תובנות לגבי הפתולוגיה של חלבון בטא עמילואיד.
- הקלה על סינון מועמדים לתרופות.
מסקנות
- שיטה זו היא כלי חשוב למחקר על מחלת אלצהיימר.
- היא מאפשרת הערכה מהירה של שינויים התנהגותיים.
- פוטנציאלית מאיצה את תהליכי גילוי התרופות.
