Name: Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Keşfedin, suya çözünür klorofil bağlayıcı proteinlerle hidrofobik pigmentleri su-içinde-yağ emülsiyonları kullanarak birleştirme yöntemini. Bu teknik, klorofil-protein etkileşimlerinin yüksek verimli tarama çalışmaları için etiketleme gerektirmeden detaylı araştırılmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

DN AB 7.ÇP projelerinin PEPDIODE (GA 256672) ve REGPOT-2012-2013-1 (GA 316157), ve İsrail Bilim Vakfı kişisel bir araştırma bursu (No 268/10) destek kabul eder. Biz konfokal mikroskopi görüntüleri çekmek için Prof. Shmuel Rubinstein, Mühendislik Okulu ve Uygulamalı Bilimler, Harvard Üniversitesi, Cambridge MA, ABD teşekkür ederim.

1. Chl bir stok Çözümler hazırlanması <ol><li> KRİTİK ADIM: ışık zararını minimuma indirmek için yeşil ışık (520 nm) veya karanlıkta altında kimyasal bir kaput klorofil hazırlık tüm adımları. Her depolama için pigmentler dondurma işleminden önce nitrojen veya argon ekleyin. Tüm çözücüler analitik dereceli olduğundan emin olun. </li><li> Tilakoit membranlarda tek Chl A içeren liyofilize Spirulina platensis&#39;in hücreleri veya diğer siyanobakteriyi hücrelerin yaklaşık 5 mg tartılır ve bir havan ve havan tokmağı kullanarak ezmek. </li><li> cam kolonuna ezilmiş hücreleri yükleyin ve karotenoidler uzaklaştırmak için yaklaşık 50-100 ml% 100 aseton ile yıkanır. akıtılarak turuncu / yeşil fraksiyonu atın. Not: turuncu fraksiyonu 100 ml aseton ile yıkanır ise yeşil fraksiyon elüte başlayana kadar aseton ile hücrelerin yıkanması devam eder. </li><li> Değişim% 100 metanol ile aseton ve CHL bir içeren yeşil kısmını toplamak. yıkandı, Fract hacmiiyon 50-100 ml arasında değişebilir. Başlangıçta, Elüe edilen fraksiyon elüsyonun sonunda soluk yeşil dönüşür koyu yeşil bir renge sahiptir. yıkandı, fraksiyonun rengi soluk yeşil içine döndüğünde elüsyon durdurun. </li><li> Ekstre tamamen kuruyana kadar bir döner buharlaştırıcı kullanılarak metanol buharlaştırın. çözüm ısı uygulamayın; evaporatör su banyosu sıcaklığı 30 ° C&#39;yi aşmayacak şekilde sağlar. Not: buharlaşma süresi buharlaştırılmadan Metanol fraksiyonunun hacmine bağlıdır ve 10-60 dakika arasında değişebilir. Tamamen kurutun önemlidir. </li><li> dietil eter (5-10 ml), küçük bir hacim içinde kurutuldu ekstreden pigmentler çözülür ve pamuk süzülür. pigmentler tam filtrelemeden önce eter emin olun. </li><li> pigmentler (10-30 dk) tamamen kuruyana kadar dietil eter buharlaşır. Not: Kuru pigment ile temizlendi ve nitrojen veya argon altında tutulabilir -20 ° C, daha sonra işlenene kadar karanlıkta. </li><li> her şey tamamen askıya bile, 100% metanol (1 mi) mümkün olan en küçük hacimde, kuru pigment çözülür. çözeltiye 4 ml aseton ekleyin ve tümüyle pigmentleri eritmek için hafifçe cam itin. </li><li> Pasteur pipeti kullanılarak, DEAE sütun% 100 aseton içinde dengelenmiş Sefaroz üzerine yavaşça örnek yüklemek. </li><li> % 100 aseton ile elüte karotenoidler (turuncu-sarı bir bant). 1 h / h oranında aseton / metanol karışımı: Daha sonra, 3 Chl bir (yeşil bant) yıkayın. Not: aseton, aseton / metanol karışımının hacmi sütunu üzerine yüklenmiş Sefaroz DEAE hacmine yaklaşık olarak eşittir. </li><li> Elüent 17 olarak 2 diklorometan / n-heksan / izopropanol / metanol (h / h) karışımı: 25: 5: CHL 68 kullanılarak ince tabaka kromatografisi ile bir saflığa edin. </li><li> Chl tamamen kuruyana kadar (bir döner buharlaştırıcı kullanılarak çözücü buharlaştırılmakta 1060 dakika). Not: Kuru Chl bir nitrojen veya argon ile temizlendi ve karanlıkta -20 ° C&#39;de argon atmosferi altında depolanır. </li><li> % 100 etanol 2-4 ml kuru Chl a yeniden eriterek CHL bir stok solüsyonu hazırlayın. Not: 663 nm&#39;de Chl a ekstinksiyon katsayısı 74.400 cm-1 M-1 (83.3 cm-1 (mg / mL) -1), etanol bulunmaktadır. Tipik bir stok çözeltisi, 25 mM (23 mg / ml) &#39;in bir konsantrasyonuna karşılık gelen 1.860 OD olmalıdır. Chl 10 kat molar fazlası, bir genel ile bir karışım içinde, organik faz 5 ml, ve sulu faz 1 ve sonuçlar ml WSCP 1 mg içeren bir emülsiyon, bu stoğun 20 ul ekleyerek WSCP. </li></ol> 2. Emülsiyon Organik fazın hazırlanması Emülsiyonun Organik faz (h / h) Span 80% 4.5 ihtiva eden mineral yağ oluşur ve% 0.4 (v / v) Tween 80: edin. <ol><li> T bir 50 ml tüp 0.2 g tartılır80 Span 80, 1.8 g, ve mineral yağı 38 g kavuştu. de tüm bileşenleri karıştırın ve buz üzerinde soğumasını. Not: Organik faz, bir haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 3. Emülsiyonun sulu fazın hazırlanması Not: emülsiyonun sulu fazı saflaştırılmış WSCP veya WSCP Aşırı Sunan Bakteriler ham ekstresi, ya meydana gelebilir. <ol><li> Saflaştırılmış WSCP ihtiva eden bir sulu fazın hazırlanması. <ol><li> 0.3-0.6 OD kadar 37 ° C&#39;de LB ortamı, 1 L WSCP plazmidi 12 içeren E.coli BL21 bakteri büyütün. </li><li> 1 mM IPTG eklenmesi ile, protein ifadesini teşvik eder. İndüksiyondan sonra 12-16 saat boyunca 30 ° C&#39;de bakterileri büyür. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüjleme ile hasat bakteri. </li><li> buz üzerinde tampon ve sonikasyon bağlama pelet (30 sn, 15 sn kapalı, beş kez) eritin. 250 ml santrifüj elde edilen topak tampon için 10 ml,protein aşırı eksprese eden hücrelere sahip LB ortamı. Not: saflaştırma yöntemine bağlı olarak, bağlama tamponu, 100 mM fosfat tamponu, pH 7.2 ya da 50 mM Tris, pH 7.5, 500 mM NaCI, 5 mM EDTA imal edilebilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 12,000 xg&#39;de hücre lizatının Spin. </li><li> afinite kromatografisi ile WSCP saflaştınlır. WSCP kaynaşmış etiketi bağlı olarak, üreticinin talimatlarına aşağıdaki protein saflaştırma için uygun ticari olarak mevcut afinite kromatografisi sistemini kullanarak rekombinant proteinleri arındırmak. </li><li> Emülsiyon hazırlanması için, 50 mM saflaştırılmış WSCP fosfat tamponu, pH 7.8 kullanımı. Sulandırma için kullanılan son protein miktarı, 1 ml tampon başına 0.5-1.0 mg olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> WSCP Ham bakteriyel lizat içeren bir sulu fazın hazırlanması. <ol><li> OD 0.3-0.6 kadar 37 ° C&#39;de LB ortamı, 250 ml plazmid ifade WSCP ihtiva eden E. coli BL21 hücrelerinden büyütün. </li><li> protein ifadesini uyarmak1 mM IPTG ve 30 ° C&#39;de gece boyunca bakteri büyür. </li><li> santrifüj ile hasat bakteri hücreleri 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 5000 x g&#39;de. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de 1-2 mi 50 mM sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.8, sonikasyon (30 saniye, 15 saniye kapalı, üç kez) ve santrifüj pelet çözülür. </li><li> 50 mM sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.8 içinde 0.875 ml süpernatan 0.125 ml karıştırılarak emülsiyonun sulu fazı hazırlanır. </li></ol></li></ol> Emülsiyon Chl a ile WSCP 4. Montaj <ol><li> Bir cam şişenin içine transfer yağı yüzey aktif madde karışımının 5 ml buz üzerinde soğutulur. pipetleme önce, organik fazın tüm bileşenler iyice karıştırıldığı emin olun ve yüzey aktif maddeler ve mineral yağı ile herhangi bir faz ayrılması bulunmaktadır. </li><li> organik faz 5 ml bölüm 3&#39;te gibi hazırlanan buz soğukluğunda sulu faz 1 ml ilave edilir. </li><li> Buz üzerinde 9,500 rpm&#39;de 2 dakika boyunca, bir doku homojenleştirici kullanarak, her iki faz karıştırılır.</li><li> KRİTİK ADIM: Bu aşamadan sonra, fotohasar en aza indirmek için yeşil ışık (520 nm) altında diğer tüm adımları uygulayın. 25 mM Chl stok çözeltisi 20 ul ekle emülsiyona (bölüm 1.13 bakınız). Flicking ve cam şişe tersini dağılırlar. Chl eşit emülsiyon dağıtılır emin olun. </li><li> karanlıkta buz üzerinde 1-2 saat boyunca emülsiyonun inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika 14,000 x g&#39;de 1.5 ml&#39;lik plastik tüplere ve santrifüj emülsiyonun aktarmak organik fazdan emülsiyonu ve ayrı su damlacıklarının parçalamak için. Not: Montaj başarılı olursa, alt sulu faz yeşil bir renge sahip olmalıdır. </li><li> Üst yağ fazı imha ve mineral yağ 1 ml. girdap ya da iyice tüpü çevirerek pelet haline emülsiyon iyi madeni yağ karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika 14,000 x g&#39;de örnek Spin. sulu ve madenci ayıran net bir menisküs kadar bu adımı yineleyinherhangi bir ara madde emülsiyon olmayan ark yağ safhaları, elde edilir. </li><li> Bir kimyasal kaputu bu adımı gerçekleştirin. Sulu ve mineral yağ safhaları, birbirinden ayrılır sonra madeni yağ çıkarın ve su ile doyurulmuş dietil eter 1 ml. Vortex ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 14.000 xg örnek aşağı doğru döndürün. İki kez bu adımı yineleyin. </li><li> İkinci santrifüj işleminden sonra dietil eter uzaklaştırılmış ve kaputu 5-20 dakika açık tüpler bırakın. </li><li> Son olarak, bir tuz giderme kolonu üzerine WSCP / Chl bir kompleks ihtiva eden sulu bir faz yük ve ileri deneyler için uygun bir tampon ile elüte. Not: Protein pH (6.0-7.5) arasında geniş bir aralıkta fosfat ve Tris tampon stabildir. Örnek bir aya kadar ışıktan korunan 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol>

<ol><li>Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotic+photosynthesis+and+phototrophy+illuminated%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated.</a> Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).</li>
<li>Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+the+difference+in+absorbance+spectra+for+the+FMO+antenna+protein+from+various+green+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth.+Res%22%5BJournal%5D)">The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria.</a> Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).</li>
<li>Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+native+and+refolded+peridinin-chlorophyll-proteins+from+dinoflagellates%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).</li>
<li>Renger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+soluble+chlorophyll+binding+protein+of+higher+plants%3A+a+most+suitable+model+system+for+basic+analyses+of+pigment-pigment+and+pigment-protein+interactions+in+chlorophyll+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes.</a> J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).</li>
<li>Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+in+Brassicaceae+plants+is+a+stress-induced+chlorophyll-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein.</a> Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).</li>
<li>Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+%28WSCP%29+of+Arabidopsis+is+expressed+in+the+gynoecium+and+developing+silique%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique.</a> Planta. 236, 251-259 (2012).</li>
<li>Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+water+soluble+chlorophyll-binding+protein+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants.</a> J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).</li>
<li>Horigome, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+and+photoprotective+function+of+water-soluble+chlorophyll-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).</li>
<li>Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -P., Reinbothe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Role+of+Water-Soluble+Chlorophyll+Proteins+in+the+Transitory+Storage+of+Chorophyllide%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide.</a> Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).</li>
<li>Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+a+water-soluble+chlorophyll+protein%2C+a+putative+carrier+of+chlorophyll+molecules+in+cauliflower%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower.</a> J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).</li>
<li>Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+water-soluble+chlorophyll+protein+from+Brassica+oleracea+var.+Botrys+binds+various+chlorophyll+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives.</a> Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).</li>
<li>Takahashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+characterization+and+analysis+of+the+intracellular+localization+of+a+water-soluble+Chl-binding+protein+from+Brussels+sprouts+%28Brassica+oleracea+var.+gemmifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera).</a> Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).</li>
<li>Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+a+water-soluble+chlorophyll-binding+protein+from+Japanese+wild+radish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish.</a> J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).</li>
<li>Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+is+involved+in+herbivore+resistance+activation+during+greening+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).</li>
<li>Hughes, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magneto-optic+spectroscopy+of+a+protein+tetramer+binding+two+exciton-coupled+chlorophylls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).</li>
<li>Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+water-soluble+chlorophyll-binding+proteins+with+native+hydrophobic+chlorophylls+in+water-in-oil+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions.</a> BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).</li>
<li>Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stereospecific+interaction+between+chlorophylls+and+chlorophyllase.+Possible+implication+for+chlorophyll+biosynthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation.</a> J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).</li>
<li>Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+properties+and+a+possible+function+of+a+water-soluble+chlorophyll+a%2Fb-protein+from+brussels+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts.</a> Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).</li>
<li>Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+water-soluble+chlorophyll-proteins+from+Lepidium+virginicum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum.</a> Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Amacımız, hidrofobik pigmentler ile suda çözünür klorofil bağlama proteinlerinin kurulması için bir yeni genel sistem geliştirmektir. Burada W / O emülsiyon dayalı yeni sulandırma sistemi rekombinant olarak E. ifade Brüksel lahanası, karnabahar, Japon horseradish ve Virginia pepperweed gelen WSCP apoproteinlerden montajı için çalışmaya kanıtlanmış genel bir yaklaşım olduğu gösterilmiştir E. coli. Burada sonuç Chl, bir 10-misli molar fazlası ile WSCP 1 mg yeniden oluşturulması arasında sunulmak...

Bu tür klorofil (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) ve karotenoidler gibi hidrofobik pigmentler elektron taşıma ve ışık enerjisi yakalama ve transfer yürütmek fotosentetik reaksiyon merkezleri ve hafif hasat proteinler birincil kofaktörleridir. Reaksiyon merkezleri ve Chl bağlayıcı ışık toplayıcı komplekslerinin en transmembran proteinlerdir. Olmayan oksijenik fotosentez yeşil-sülfür bakterilerin 1,2 Fenna-Matthews-Olson (FMO), protein, ve dinoflagellatlar 3 peridinin-Chl proteini (PCP) suda çözünür ışık toplayıcı proteinlerin olağanüstü örneklerdir. Suda çözünür klorofil bağlama proteinleri (WSCPs) Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae ve Amaranthaceae bitkiler 4, 5, başka bir eşsiz bir örnek, henüz FMO ve PCP aksine, bu hafif hasat ne de birincil fotosentetik reaksiyon herhangi de katılmaktadırlar ve onların kesin physiological fonksiyonları henüz 5-8 belirsizdir. Bunların yüksek Chl-bağlama çekiciliği, geçici Chls taşıyıcıları ve CHİ türevleri 9,10 olarak önerilen bir işleve yol açmıştır. Seçenek olarak ise, bu WSCP zarar hücrelerde Chls tutucu bir rol oynar ve Chl kaynaklı fotooksidatif hasara 7,11-13 karşı koruma olduğu varsayılmıştır. Daha yakın zamanda, bir proteaz inhibitörü olarak bu WSCP işlevleri ileri ve otçul direnci sırasında önemli bir rol oynar gibi çiçek gelişimi 14 esnasında hücre ölümünü düzenlemektedir. WSCPs kendi fotofiziksel özelliklere göre iki ana sınıfa ayrılır. Birinci sınıf (sınıf I, örneğin. Chenopodium albümünden) aydınlatma üzerine Fotoçevrim uğrayabilir. Fotoçevrim 5,10 uğramayan Brassica bitkileri, gelen Sınıf II WSCPs, başka bir sınıfı IIa bölünmüştür (örn., Brassica oleracea, Raphanus sativus elde edilmiş) ve IIb (örn., Lepidium virginicum gelen </em&gt;). Lepidium virginicum Sınıf IIb WSCP yapısı 2.0 Å çözünürlükte 8 X-ışını kristalografisi tarafından çözüldü. Bu protein alt-birimleri, bir hidrofobik çekirdek oluşturan bir simetrik homotetramer ortaya koymaktadır. Her bir alt-birimi, tüm Chl düzenlemesi Chl-protein kompleksleri bağlanmasını ve montaj çalışmaları için WSCPs potansiyel olarak yararlı bir model sistemi sağlar, basit core.This içinde dört yakından dolu Chls sıkı bir düzenleme ile sonuçlanan tek bir CHL ve Chls komşu etkilerini bağlanan ve bireysel Chls spektral ve elektronik özellikleri protein ortamları. Ayrıca, yapay fotosentetik cihazlar ışık hasat modüller için kullanılabilir yapay Chl bağlayıcı proteinler oluşturmak için şablon sağlayabilir. Bitkilerden izole kompleksleri her Chl a farklı kombinasyonları ile tetramerleri heterojen bir karışımı içerdiğinden nativ WSCPs titiz çalışmaları mümkün değildirve Chl b 9. Bu nedenle, in vitro Chls ile rekombinant olarak ifade WSCPs monte edilmesi için bir yöntem olup gereklidir. Bu 15 gösterilmiştir tilakoit membranlarla apoprotein karıştırarak. Imkansız basit sulu çözeltiler içinde pigmentler ile suda çözünür apoprotein karıştırılmasıyla in vitro kompleks montajı yapar Chls ihmal edilebilir suda çözünürlüğü ile in vitro olarak toplanması meydan, ama Bu yöntem, Thylakoid&#39;in nativ Chls mevcut sınırlıdır. Schmidt ve ark. rekombinant olarak E. bir histidin-etiketli proteini ifade ederek karnıbahar (CaWSCP) den WSCP ile birkaç Chl ve BChl türevleri montaj bildirildi E. coli, bir Ni-afinite sütunu üzerine hareketsiz ve deterjanlar 11 içinde çözünür Chl türevleri sokulması. Başarıyla A. Rekombinant WSCPs yeniden oluşturulması thaliana 6, ve Brüksel lahanası (BoWSCP), Japon turp (RshWSCP) birbenzer bir yöntemle D Virginia pepperweed (LvWSCP) bildirilmiştir. Burada, bir roman, proteinler etiketleme gerektirmez WSCP ile Chls montaj veya immobilize genel, basit bir yöntem mevcut. Mineral yağ içinde suda çözünür apoproteinlerden sulu çözeltilerden emülsiyonları hazırlamak dayanır. Proteinleri, hacim oranı 16 su-içinde-yağ (o / w), çok yüksek bir yüzey ile mikro damlacıklar içinde kapsüllenir. hidrofobik kofaktör daha sonra yağ içinde eritilir ve hali hazırda yağ fazından damlacıklar halinde yerleştirilir. Biz rekombinant olarak E. ifade WSCP apoproteinlerden çeşitli türevleri montajı için yöntem kullanılarak rapor Chl bir ile E. coli. Bu yeni Chl bağlayıcı proteinler geliştirmek için bir eleme sistemi olarak kullanılabilir WSCP-aşırı ifade eden bakteriler, ham lizat düzeneğini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Span80</td><td>Sigma</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>Biyo-Ölçekli Mini Profinity eXact Kartuşları</td><td>Bio Rad</td><td>10011164</td><td>Doğal dizi ile WSCP saflaştırması için afinite kromatografisi.</td></tr><tr><td>His Trap HF sütunu</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5248-02</td> His-tag DEAE Sefaroz Hızlı Akış ile <td>WSCP saflaştırması için afinite kromatografisi</td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-0709-01</td><td>Klorofil saflaştırması için kromatografi ortamı</td></tr></tbody></table>

petrol emülsiyonlar su: hidrofobik pigmentler ile suda çözünür klorofil bağlayıcı proteinler montaj için yeni bir sistem

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Klorofil (Chls) ve bacteriochlorophylls (BChls) fotosentez ışık hasat ve elektron taşıma yürütmek birincil kofaktörleridir. Onların işlevselliği eleştirel büyük ve ayrıntılı birden fazla alt transmembran protein komplekslerinin içinde kendi özel organizasyon bağlıdır. Bu kompleksler güneş enerjisi dönüşüm nasıl kolaylaştıracağını moleküler düzeyde anlamak için, protein-pigment ve pigment pigment etkileşimleri ve heyecanlı dinamikleri üzerindeki etkisini anlamak için önemlidir. Bu bulgu elde etmenin bir yolu oluşturmak ve basit suda çözünür rekombinant proteinlerle Chls komplekslerini inceleyerek gereğidir. Bununla birlikte, suda çözünür protein halinde lipofilik Chls ve BChls içeren zordur. Ayrıca, hidrofobik pigmentler ile suda çözünür proteinler montajı için kullanılabilir genel bir yöntem vardır. Burada, eşek sağlayan su içinde yağ emülsiyonları dayalı basit ve yüksek verimli sistemi göstermektedirhidrofobik Chls suda çözünür proteinlerin embly. Yeni yöntem Chl, bir ile Brassicaceae bitki (WSCP) suda çözünür klorofil bağlayıcı proteinin rekombinan versiyonları monte ile doğrulandı. Biz Chl başarılı derleme E. ifade WSCP bir kullanarak ham lizatları göstermek suda çözülebilen yeni bir Chl bağlayıcı proteinler için genetik ekran sistemi geliştirmek için kullanılabilir ve Chl-protein etkileşimleri ve montaj işlemlerinin çalışmalar için edilebilir coli hücre.

Rekombinant WSCP apoproteinler önceki bölümde tarif edilen protokole göre W / O emülsiyonları Chl A ile birleştirildi. Protokol saf WSCPs veya lizatları E. coli hücreleri WSCP aşırı eksprese eden (Şekil 1) ya da ihtiva eden sulu fazlar kullanılarak uygulanmıştır. protokol hızlı, basit ve bir doku homojenleştirici dışında herhangi bir özel ekipman gerektirmez. Bu, ilgili ana kompleksleri ...

Bu yazıda, su içinde yağ emülsiyonları göre hidrofobik pigmentler ile suda çözünür proteinler monte edilmesi için, basit ve yüksek verimli bir yöntem tarif eder. Biz Brassica bitkileri E. ifade rekombinant suda çözünür-klorofil dört varyant bağlayıcı proteinler (WSCPs) ile yerli klorofil montajında ​​yöntemin etkinliğini gösteren E. coli.

Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Bu tekniğin genel amacı, suda çözünmeyen klorofillerin, suda çözünür proteinlerin bağlanma bölgelerine dahil edilmesini sağlamaktır. Bu yöntem, klorofillerin rekombinant proteinlerle birleştirilmesine olanak tanıyarak klorofil-protein etkileşimlerinin titizlikle incelenmesine imkan verir ve yeni klorofil-protein kompleksleri oluşturmak için yeni olasılıklar açar. Bu tekniğin temel avantajı, proteinlerin etiketlenmesini veya immobilize edilmesini gerektirmemesidir.Bu nedenle, tarama analizleri için oldukça uygundur. Prosedürü, araştırma grubumdaki doktora sonrası araştırmacı Dominica Bednarczyk gösterecektir. Aşağıdaki stok çözeltileri hazırlarken, foto-hasarı minimize etmek için tüm klorofil hazırlama adımlarını bir kimyasal çeker ocak altında, yeşil ışık altında veya karanlıkta gerçekleştirin.Pigmentleri saklamak için dondurmadan önce her zaman azot veya argon ekleyin ve tüm çözücülerin analitik saflıkta olduğundan emin olun. Başlamak için, yaklaşık beş gram liyofilize Spirulina platensis hücresi veya sadece tilakoid membranlarda klorofil a içeren diğer siyanobakteri hücrelerini tartın ve bunları ezmek için bir havan ve havan eli kullanın. Klorofil ekstraksiyonu sırasındaki kritik

water-oil-emulsions-new-system-for-assembling-water-soluble

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu protokol, hafif hasat komplekslerinin in vitro olarak yeniden yapılandırılmasını detaylandırır. Bu entegre zar proteinleri, klorofilleri ve karotenoidleri koordine eder ve daha yüksek bitkilerde ve yeşil alglerde ışığın toplanmasından sorumludur.

Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

Organik boya molekülleri ve oleik asit kaplı yukarı dönüştürücü nanopartiküller suda çözünür değildir. Bu protokol, organik boya moleküllerinin transferini ve partiküllerin başlangıçtaki hidrofobik çözücülerinden suya yukarı dönüştürülmesini sağlayan bir 'tak ve çalıştır' yöntemini tanımlar.

A &#39;Tak ve&#39; Yöntem, bir Amfifilik Polimer, Organik maddeler ve upconverting Nanopartiküller İçeren Su dağılabilir Nanoassemblies oluşturma

Bu makale, bağımsız filmlerde ve emprenye edilmiş membranlarda hidrojeller hazırlamak ve su taşıma özellikleri de dahil olmak üzere fiziksel özelliklerini karakterize etmek için pratik yöntemleri bildirmektedir.

Su Arıtma Membranlar olarak Zehirli Özelliklere Sahip Hidrojeller Sentezi

Bu iletişim kuralı peptid ve amino asit çözümler kendi kendine montaj bileşimlerini kullanarak bir sulu ortamda hidrofobik bileşikler eriterek klinik olarak uygulanabilir Aracı açıklanır. Bizim yöntem klinik ayarları çözünürlük ve teslim yöntemleri güvenli, verimli araçlarının eksikliği hidrofobik therapeutics büyük bir sınırlama giderir.

Çözünürlük sulu çözüm peptid ve Amino asit kendi kendine montaj bileşimlerini kullanarak hidrofobik bileşiklerin

Burada, bir protokol fucoxanthin klorofil a/c proteinler (FCP) Diyatomlarla dan ayırmak ve onları uyarma enerji transferi iyon kompozisyon değişiklikleri üzerine çalışmaya doğal lipit kompozisyonları ile lipozomlar içine dahil mevcut.

İzole ve ışık-hasat antenler Diatom Cyclotella Meneghiniana lipozomlar Thylakoid lipidler ile gelen ekleme

Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.

Elastin benzeri Proteinlerin tanımlanmış Supramoleküler Yapılara Yönlendirilmiş Montajı ve Tüp Bebek Tespülasyonu

Biz bakır ile lipid bilayer doping tarafından su / hava arayüzü bir hibrid lipid membran üretmek için bir protokol rapor (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthayanilocne (CuPc) molekülleri. Ortaya çıkan hibrid lipid membran lipid/CuPc/lipid sandviç yapısına sahiptir. Bu protokol diğer fonksiyonel nanomalzemelerin oluşumuna da uygulanabilir.

Su/Hava Arabiriminde Hidrofobik Organik Moleküllerle Doped Hibrid Lipid Membranların Kendi Kendine Montajı

İlaç taşıyıcı uygulamalar için kullanılan yağlar, hastaların lipid profilini bozabilir, bu da kardiyovasküler hastalıklarda istenmeyen bir durumdur. Omega-3 yağ asitleri açısından zengin yağlar, geleneksel yağlara sağlıklı bir alternatiftir ve kendi kendine emülsifiye edilmiş ilaç dağıtım sistemleri için muazzam bir potansiyele sahiptir.

Lipofilik İlaçların Çözünürlüğünü Arttırmak için Sağlıklı Yağların Kendi Kendine Nanoemülsifikasyonu

Mevcut protokol, biyouyumlu lipozomlar üretmek için mikroakışkan bir teknik olan oktanol yardımlı lipozom montajını (OLA) tanımlamaktadır. OLA, verimli kapsülleme ile monodispersed, mikron boyutunda lipozomlar üretir ve anında çip üzerinde deneylere izin verir. Bu protokolün sentetik biyoloji ve sentetik hücre araştırmaları için özellikle uygun olması beklenmektedir.

Biyomühendislik için On-Chip Oktanol Destekli Lipozom Montajı

Bu protokol, sentetik hücrelerin yapımında kullanılan Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini tanımlar. Farklı mikro bölmelerde temsili sonuçlarla temel aşamaları ana hatlarıyla belirtir. Protokol, sentetik hücre topluluğundaki çeşitli laboratuvarlar için en iyi uygulamaları oluşturmayı ve sentetik hücre gelişiminde ilerlemeyi ilerletmeyi amaçlamaktadır.

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

Keşfedin, suya çözünür klorofil bağlayıcı proteinlerle hidrofobik pigmentleri su-içinde-yağ emülsiyonları kullanarak birleştirme yöntemini. Bu teknik, klorofil-protein etkileşimlerinin yüksek verimli tarama çalışmaları için etiketleme gerektirmeden detaylı araştırılmasını sağlar.

Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem

Daha fazla video keşfet