Die Transformation von probiotischen Hefe und ihre Erholung von Magen-Darm-Immun Geweben nach orale Gabe bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, einen Stamm probiotischer Hefe zu entwickeln, der leicht transformiert werden kann, um heterologes Protein zu exprimieren und in den gastrointestinalen Trakt der Maus zu liefern. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie eine schnelle Erzeugung oxytropher Stämme probiotischer Hefe ermöglichen. Diese mutierten Hefen können dann genetisch manipuliert werden, ohne auf die Auswahl von Antibiotika angewiesen zu sein.

Die orale Sonde von Mäusen und die Ernte von Peyer-Pflastern ermöglichen auch die Überprüfung der Adhärenz der mutierten Hefe am gastrointestinalen Immungewebe. Diese Methoden werden dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der oralen Impfung zu beantworten und Experimente zur Erprobung von Probiotika für die Verabreichung von gastrointestinalen Therapeutika zu ermöglichen. Nach der Vorbereitung des YPD-Mediums und dem Wachsen der Hefe über Nacht bis zur Sättigung die Zellen eins bis zehn in Wasser in einer Kunststoffküvette verdünnen.

Befestigen Sie dann ein Spektralphotometer und bestimmen Sie die optische Dichte der Übernachtkultur. Mit 20 Millilitern sterilem destilliertem Wasser verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 10 bis siebten Zellen pro Milliliter. Gießen Sie dann die verdünnten Zellen in eine sterile Petrischale aus Kunststoff und legen Sie die Platte nach abgenommenem Deckel in einen UV-Vernetzer.

Als nächstes setzen Sie die Zelllösung kumulativen inkrementellen Dosen von UV-Strahlung aus und extrahieren Sie nach jedem Inkrement 500 Mikroliter-Aliquoten, um eine Abtötungskurve zu erstellen und das optimale prozentuale Überleben für das Screening zu ermitteln. Verwenden Sie steriles Wasser, um die Zellen in Schritten von einem bis zehn Stück nacheinander zu verdünnen. Pelletieren Sie dann die Zellen aus jeder Verdünnung durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für eine Minute.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Volumen von 100 Mikrolitern sterilem Wasser, das für die Beschichtung von Hefezellen geeignet ist. Pipettieren Sie dann das gesamte Volumen der resuspendierten Zellen auf Platten, die festes YPD-Medium enthalten, und verwenden Sie einen sterilen Spreader, um die Zellen gleichmäßig auf jede Platte zu verteilen. Erstellen Sie eine Überlebenskurve und bestimmen Sie die Dosis der UV-Strahlung, die für das Screening gemäß dem Textprotokoll verwendet werden soll.

Nachdem Sie die Hefe der für das Screening ausgewählten Dosis von UV-Strahlung ausgesetzt haben, pelletieren Sie das gesamte Volumen der bestrahlten Zellen und verwenden Sie 100 Mikroliter steriles Wasser, um das Pellet wieder zu suspendieren. Plattieren Sie auf ein minimales Medium, das 5-FOA gemäß dem Textprotokoll enthält, um Ihre drei minus oxytrophen Newton auszuwählen. Bestätigen Sie den URA3-Minus-Phänotyp, indem Sie mit der Spitze eines sterilen Zahnstochers einen Teil einer einzelnen Kolonie auf der 5-FOA-Platte sammeln und auf YPD-, 5-FOA- und Uracil-Minus-Platten übertragen.

Wickeln Sie die Platten ein und inkubieren Sie kopfüber bei 30 Grad Celsius für zwei bis vier Tage. Bestätigen Sie den oxytrophen Status, indem Sie das Wachstum der Kolonien auf YPD und 5-FOA überprüfen, jedoch nicht auf Uracil-Minus-Platten. Nachdem Sie den URA-3-Minus-Status der bestrahlten Hefe bestätigt haben, richten Sie einen Nachtfilter für die Lithiumacetat-Umwandlung ein, indem Sie 10 Milliliter YPD mit einer einzigen mutierten Kolonie beimpfen und in einem warmen Raum bei 30 Grad Celsius inkubieren.

Verwenden Sie am nächsten Tag 50 Milliliter frisches, warmes YPD, um die Übernachtkulturen auf einen OD600 von 0,16 bis 0,2 zu verdünnen, und inkubieren Sie die Zellen auf einem orbitalen Plattformschüttler, der auf 200 U/min eingestellt ist, bis die Kultur etwa eins mal 10 bis die siebte Zellen pro Mille erreicht, normalerweise etwa vier Stunden. Nachdem Sie die Zellen gemäß dem Protokoll mit Wasser und Lithiumacetat gewaschen haben, fügen Sie 50 Mikroliter resuspendierter Zellen zu einer Transformationsmischung aus Plasmid und Träger-DNA hinzu. Fügen Sie dann 300 Mikroliter PEG, TE und Lithiumacetat hinzu und wirbeln Sie es auf.

Inkubieren Sie die Präparate bei 30 Grad Celsius auf einem orbitalen Plattformschüttler bei 200 U/min für 30 Minuten. Fahren Sie mit der Transformation fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach der Vorbereitung der Hefekulturen gemäß dem Textprotokoll wird die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer bestimmt und auf 10 bis neunte Zellen pro Milliliter eingestellt.

Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2500 mal G für drei Minuten. Gießen Sie dann den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie die entsprechende Menge sterilen Wassers hinzufügen und vorsichtig auf und ab pipettieren. Befestigen Sie eine Sondennadel mit geeigneter Stärke auf einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze und laden Sie die Hefeprobe, um alle Luftblasen zu entfernen.

Laden Sie eine zusätzliche Spritze mit sterilem Wasser, um die Kontrollmäuse zu sondieren. Nehmen Sie mit der nicht dominanten Hand die zu öffnende Maus auf und fassen Sie mit Zeigefinger und Daumen die Haut um den Hals fest. Stecke den Schwanz unter den kleinen Finger.

Stellen Sie sicher, dass der Griff fest sitzt und die Maus ihren Kopf nicht bewegen kann. Führen Sie dann die Sondennadel vorsichtig in die Speiseröhre der Maus ein, indem Sie die Nadel entlang des Gaumens und des Rachens anwinkeln und dabei leicht links von der Mitte halten. Warten Sie, bis die Maus den Nadelknollen verschluckt hat.

Wenn ein Widerstand zu spüren ist oder die Maus nach Luft schnappt, entfernen Sie vorsichtig die Nadel und versuchen Sie erneut, die Speiseröhre zu finden. Nachdem die Maus den Knollen der Sondennadel verschluckt hat, drücken Sie vorsichtig auf den Spritzenkolben, um die Hefe direkt in den Magen der Maus zu verabreichen. Entfernen Sie die Sondennadel vorsichtig aus dem Magen und der Speiseröhre der Maus und setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein.

Überprüfen Sie, ob die Maus normal atmet und sich bewegt, um sicherzustellen, dass die Sonde ordnungsgemäß durchgeführt wurde. Nachdem Sie die Maus gemäß dem Textprotokoll geopfert haben, positionieren Sie sie mit vollständig freiem Bauch und verwenden Sie 70% Ethanol, um den Bauchbereich zu besprühen. Machen Sie mit einer Schere einen Querschnitt durch das Fell und die Haut.

Hebeln Sie dann den Schnitt manuell auf, um das Peritoneum, die dünne Serosalauskleidung, die die Bauchorgane bedeckt, weiter freizulegen. Heben Sie das Bauchfell vorsichtig an und machen Sie einen Querschnitt, um den Darm freizulegen. Verwenden Sie dann eine stumpfe Pinzette, um den Dünndarm vorsichtig von den Mesenterialarterien, dem Fett und anderen Geweben wegzuführen.

Setzen Sie den Dünndarm vom Magen aus im oberen linken Quadranten des Mäusebauchs dem Blinddarm aus, der großen Tasche aus Darmgewebe am Anfang des Dickdarms. Isolieren Sie als Nächstes Peyer-Flecken, indem Sie entlang des Dünndarms nach ein bis zwei Millimeter großen, etwa kreisförmigen Flecken aus undurchsichtigem Gewebe suchen. Schneiden Sie dann mit einer gebogenen Präparierschere die Kuppel des Peyer-Pflasters ab und lassen Sie Ränder übrig, um sicherzustellen, dass kein umgebendes Gewebe entnommen wird.

Übertragen Sie die sezierten Peyer-Patches in vollständiges IMDM. Gießen Sie dann die Lösung mit den suspendierten Peyer-Pflastern auf ein 40-Mikrometer-Zellensieb. Nachdem Sie die Peyer-Pflaster mit vollständigem IMDM gewaschen haben, verwenden Sie einen Kolben aus einer Ein-Milliliter-Spritze, um das Gewebe vorsichtig aufzubrechen, und sammeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen.

Pelletieren Sie die gespannten Zellen sieben Minuten lang bei 1800 U/min. Plattieren und analysieren Sie dann die Zellen gemäß dem Textprotokoll. Diese Abbildung zeigt eine Plattierung aus einer seriellen Verdünnung von bestrahlten S Boulardii-Zellen.

Die serielle Verdünnung stellt sicher, dass die CF-Verwendung bei jeder UV-Dosis aufgezählt werden kann. Aus diesen Bildern von Hefeplatten geht hervor, dass das konsistente Wachstum der mutierten Kolonien auf YPD und 5-FOA, aber nicht auf Uracil-Minus-Platten, auf einen Uracil-Minus-oxytrophen Phänotyp hinweist. Diese Grafik veranschaulicht die Transformationseffizienz für den Wildtyp S Boulardii im Vergleich zu S Cerevisiae, wobei sowohl Lithiumacetat- als auch Elektroporationstechniken verwendet wurden.

Obwohl die Umwandlung von Lithiumacetat für S Cerevisiae sehr effizient ist, wird die Umwandlungseffizienz für S Boulardii durch Elektroporation erheblich verbessert. In diesen Hellfeld- und Fluoreszenzbildern zeigt S Cerevisiae, transformiert mit einem URA3-Plasmid, das GFE umhüllt, eine funktionelle Expression eines heterologen Proteins. In dieser Abbildung ist ein Beispiel für eine lebensfähige CF-Verwendung zu sehen, die an Peyer-Pflastern nach der Sektion von Tieren nachgewiesen wurde.

Eine typische Ausbeute an gewonnener CF-Nutzung pro Maus beträgt weniger als 10. Sie sollten jetzt ein gutes Verständnis dafür haben, wie man oxytrophe mutierte Stämme probiotischer Hefe mithilfe der UV-Mutagenese erzeugt. Wir haben auch beschrieben, wie man die Fähigkeit dieser Hefen testen kann, heterologe Proteine zu exprimieren und an Peyer-Flecken des Dünndarms der Maus zu haften.

Im Anschluss an diese Verfahren können andere Methoden wie ELISA und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die korrekte Faltung und Funktion der exprimierten heterologen Proteine zu bewerten.