Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Bu görüntüleme yönteminin genel amacı, bir omurgalıda in vivo olarak hücre altı organelleri incelemektir. Bu yöntem, mitokondri veya sentrozomların in vivo bağlamdaki dinamikleri gibi nöronal hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tüm deneyin herhangi bir cerrahi işleme gerek kalmadan, sağlam bir omurgalı üzerinde gerçekleştirilebilmesidir.

Bu yöntem, yalnızca fizyolojik koşullar altındaki hücre altı dinamikler hakkında bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda Alzheimer hastalığı gibi hastalık modellerinin çalışmalarına da uygulanabilir. Metin protokolüne uygun olarak, mikroenjeksiyon yoluyla geçici olarak ifade eden embriyolar oluşturulduktan veya stabil transgenik hatlardan embriyolar elde edildikten sonra, birinci günün sonunda ölü veya döllenmemiş yumurtalar için tarama yapın. Pigment oluşumunu önlemek için 1x PTU içeren Danieau çözeltisine canlı embriyoları plastik bir transfer pipeti kullanarak aktarın ve transgen ekspresyonu taramasına kadar embriyoları 1x PTU içeren Danieau çözeltisinde muhafaza edin.

Görüntüleme deneyinin yapıldığı gün, anestezi altındaki embriyoları transgen ekspresyonu açısından taramak için bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanın. Ardından, seçilen embriyoları 1x PTU ve 1x trikayn içeren Danieau tamponu bulunan ayrı bir petri kabına aktarın. Embriyolar anestezi altına alındıktan sonra, agarozun seyrelmesini önlemek için mümkün olduğunca az sıvı aktararak, birkaç tanesini nazikçe 1x PTU ve 1x trikayn içeren düşük erime noktalı agarozun içine pipetleyin.

Embriyoları az miktarda agaroz ile birlikte cam tabanlı bir petri kabına aktarın. Ardından, nispeten hızlı çalışarak, görüntülenecek yapıya bağlı olarak embriyoları istenen yönlendirmeye getirmek için pens kullanın. Embriyoların, örneğin retinanın veya bir Rohon-Beard nöronunun görüntülenmesi için yan tarafı düz gelecek şekilde uygun şekilde yönlendirilmesi gerekir.

Hassas bir yönlendirme, en iyi görüntüleme kalitesini sağlayacak ve veri toplama hızını optimize edecektir. Agarozun katılaşması için en az 15 dakika bekledikten sonra, embriyoları kaplayacak şekilde 1x PTU ve 1x trikain içeren Danieau tamponu ekleyin. Geniş alan mikroskopisi gerçekleştirmek için, monte edilmiş balıkların bulunduğu bir kabı 28.5 °C'lik bir ısıtma odasında dengeledikten sonra, geniş alan mikroskobunun tablasına yerleştirin, ilgi çekici bir alan seçin ve mikroskop yazılımını açın.

Aydınlatma (Illumination) sekmesi altında, ilgilenilen dalga boyu için doğru filtre setlerini tanımlamak üzere Yapılandırma (Configuration) ayarlarına tıklayın. Kamera (Camera) ayarları altında, uygun bir görüntü elde etmek için gereken pozlama süresini girin. Ardından, 40x ile 100x büyütme aralığında, en yüksek sayısal açıklığa sahip ve kromatik düzeltmeli, uzun çalışma mesafeli bir su daldırma konik objektif seçin.

Bakış alanını seçmek için Canlı (Live) kısmına tıklayın. R-B nöronu durumunda, hücre gövdesinden çıkan akson gövdesinde veya periferik arbor içinde mitokondriyal transportu görüntüleyin. Ardından, ImageJ menüsünde dikdörtgen seçim düğmesine tıklayın ve bir ilgi bölgesi (ROI) tanımlayın.

Ve micromanager penceresindeki ROI'ye tıklayın. Görüntüleme için ROI'yi seçtikten sonra, nöronal morfolojiyi YFP kanalında kaydetmek için Stop and Save'e tıklayın. Mitokondriyal transportu görüntülemek için Multi-D Acquisition'a tıklayın.

Ardından, Çok Boyutlu Edinme (Multi-dimensional Acquisition) adlı pencerede, zaman noktası sayısını ve zaman noktaları arasındaki aralığı seçin. Çok Boyutlu Edinme penceresinde Kanallar (Channels) sekmesine tıklayın; görüntüleme için dalga boyunu ve pozlama süresini ekleyip tanımlayın. Dosyaların dizin yolunda belirtilen özel klasöre otomatik olarak kaydedilmesi için Görüntüleri Kaydet (Save images) seçeneğine tıklayın.

Şimdi, zaman ayarlı görüntülemeyi başlatmak için sağ üst köşedeki Acquire seçeneğine tıklayın. Konfokal mikroskopi için, monte edilmiş embriyoları konfokal sahnesindeki 28.5 °C'lik bir ısıtma odasına yerleştirdikten sonra mikroskop yazılımını açın ve Trans Lamp veya Epi Lamp seçeneğine tıklayın. Ardından, mikroskobun okülerleri aracılığıyla, ilgi bölgesini belirlemek için sırasıyla iletim ışığını veya floresan ışığını kullanın.

Kazanım (Acquisition) ayar penceresinde, görüntüleme için seçilen objektifin, mevcut objektiflerin açılır menüsünde görünen objektifle eşleştiğini doğrulayın. Ardından, Görüntü Kazanım Kontrol (Image Acquisition Control) penceresinde, boya listesi düğmesine tıklayın ve uygun floroforları seçin. Alternatif olarak, parametreleri manuel olarak ayarlamak için Işık Yolu ve Boyalar (Light Path and Dyes) düğmesine tıklayın.

Edinim Ayarları penceresinde, görüntülenen yapıların en iyi şekilde çözümlenmesi için gerekli piksel boyutunu elde etmek amacıyla taranan görüntünün yakınlaştırma faktörünü ve boyut en-boy oranını ayarlayın. Nyquist örnekleme kriterlerine uymak için piksel boyutunu, objektifin teorik çözünürlüğünün yaklaşık yarısına ayarlayın. Edinilen bir görüntünün piksel boyutunu belirlemek için Görüntü Edinimi Kontrol penceresinde I düğmesine tıklayın.

Ardından, tarama hızını mümkün olan en yüksek seviyeye ayarlayın. Sonra, Görüntüleme Kontrol penceresinde, gürültüyü azaltmak için Kalman çizgi ortalamasına tıklayın ve faktörü iki veya üç olarak ayarlayın. Spektrumları örtüşen floroforları görüntülemek için ardışık bir tarama modu seçmek üzere, Ardışık ve Çizgi seçeneklerine tıklayın.

Ardından, ilgili lazer hatlarının güç çıkışını ayarlayın. Detektör ayarlarını her kanal için düzenlerken seçilen bölgeyi sürekli taramak için XY Repeat veya Focus x2 ya da Focus x4 seçeneğine tıklayın. Daha sonra, gri değerlerinin en yüksek dinamik aralığına sahip görüntüleri elde etmek için her kanalın HV, Gain ve Offset değerlerini ayarlayın.

Şimdi, doygunluk altına düşmüş pikselleri mavi, aşırı doygun pikselleri ise kırmızı olarak tanımlayan ve her ikisinden de kaçınılması gereken bir arama tablosu üzerinden edinilen görüntüleri görselleştirmek için Control artı H tuşlarına basın. İlgili lazer hatlarının güç çıkışını ve dedektör ayarlarını yeniden değerlendirin. Görüntülenecek hacmin üst ve alt sınırlarını belirlemek için, Acquisition Setting kısmında üst sınırdayken End Set düğmesine tıklayın, ardından alt sınıra odaklanarak Start Set düğmesine basın.

Objektifin Z çözünürlüğünü kontrol etmek için Görüntüleme Kontrolü'nde I sembolüne tıklayın. Ardından, söz konusu objektif için Z çözünürlüğünün yarısı kadar bir adım boyutu seçin. TimeScan alt penceresinde, görüntülenmesi planlanan hücre altı yapının dinamiklerine uygun bir zaman serisi oluşturmak için Z-yığınlarının alınacağı frekansı ve görüntülerin kaç kez alınacağını girin.

Z-yığını ve zaman serisinin alınacağını onaylamak için Derinlik ve Zaman düğmelerine tıklayın. Son olarak, zaman ayarlı görüntüleri almaya başlamak için XY Zt düğmesine tıklayın. Görüntü alımı tamamlandıktan sonra, yazılım arayüzünde Seri Tamamlandı'ya tıklayın.

Görüntüleri ve ilgili üst verileri kaydetmek için görüntüleri OIB formatında kaydedin. Bu şekil, geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanılarak embriyo yüzeyinde bulunan organelleri ve R-B nöronlarını göstermektedir. Burada, bir R-B nöronunun periferik arborundaki tek bir mitokondriyumun hareketini izlemek için geniş alan mikroskobunda zaman ayarlı görüntüleme kullanılmıştır.

Konfokal görüntüleme önemli ölçüde daha yavaştır ve belirli hücre altı olayların dinamiklerinin olduğundan az tahmin edilmesine yol açabilir. Geniş alan mikroskopisi ile elde edilen retinal hücre görüntüleri, geniş bir doku hacminden gelen floresan sinyallerinin odak düzlemindeki ayrıntıları gizlemesi nedeniyle düşük kontrast sorunu yaşarlar. Burada, konfokal mikroskopinin optik kesit alma kapasitesi kontrastı belirgin şekilde artırır.

Ekler, hücresel membranların ve mitokondrilerin işaretlendiği iç nükleer tabakanın bir bölgesinin detaylarını göstermektedir. Bir duyusal nöronun spesifik Gau-4 sürücüsü tarafından yönlendirilen, UAS-mito-CFP ve UAS MAY-FP enjeksiyonlarından kaynaklanan mozaik ekspresyon, döllenmeden iki ve üç gün sonraki bu R-B duyusal nöronunda görüldüğü gibi, bireysel hücrelerin günler boyunca takip edilmesine olanak tanır. Mitokondrilerin yanı sıra, sentrozomlar gibi diğer hücre altı organeller de floresanla işaretlenebilir.

Bu örnekte, tek bir kesintisiz konstrüksiyon üzerindeki iki UAS kaseti, retinal hücrelerde sentrozom hedefli YFP ve membran hedefli cerulean ekspresyonunu sağlamıştır. Ek görseller M evresindeki bir hücreyi göstermektedir. Bu prosedürün tamamı; çiftleştirme, yumurta toplama, enjeksiyonlar ve nihayetinde döllenmeden üç veya dört gün sonra görüntüleme yapılmasıyla birlikte birkaç gün sürmektedir.

Mikroskoptaki asıl görüntüleme deneyi birkaç dakika ile tüm bir gün arasında sürebilir. Bu prosedürün ardından, in-vivo dinamiklerini anlamak amacıyla mikrotübüller veya peroksizomlar gibi diğer organeller işaretlenebilir ve görüntülenebilir. PTU'nun karsinojen olduğunu ve bu prosedür gerçekleştirilirken eldiven giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.