"인간 답게"를 생성

이 실험의 전반적인 목표는 Kinesin-5 모터의 저분자 억제제에 민감한 Drosophila S2 세포주를 생성하여, 이를 오류 수정 연구에 활용하는 것입니다. 세포 분열 중의 오류 수정은 잘못된 kinetochore와 미세소관 간의 상호작용을 불안정하게 만들어, 세포가 적절한 부착을 형성할 수 있는 두 번째 기회 또는 또 다른 기회를 제공함으로써 게놈이 제대로 분리될 수 있도록 하는 과정입니다. 이 방법은 오류 수정 과정과 관련된 세포 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 염색체 수가 더 적고 Kinesin-5 억제제에 민감한 Drosophila S2 세포주를 사용할 수 있다는 점이며, 이 두 가지 요소 모두 개별 오류 수정 사건의 시각화를 용이하게 합니다. 100% 합류된 GFP-Alpha Tubulin 발현 S2 세포가 배양된 25 cm² 플라스크에서 2 mL의 배양액을 35 mm 디쉬로 옮깁니다. 그다음, 세포가 반쯤 부착되도록 상온에서 약 1시간 동안 배양합니다.

디쉬에서 배지를 제거하고, FBS가 첨가된 Schneider's medium 1 mL를 2 µg의 Eg5-mCherry 컨스트럭트 및 transfection reagent와 함께 첨가하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포를 transfection합니다. Parafilm으로 디쉬를 밀봉하고 25 °C에서 16~18시간 동안 세포를 배양합니다. 그 후 Schneider's medium 1 mL를 추가하고 세포를 다시 인큐베이터로 옮깁니다.

형질전환 후 3일째에, 테스트 유도를 위해 1.5 mL의 Schneider's medium이 담긴 새로운 35 mm 조직 배양 접시에 형질전환된 세포 500 µL를 옮깁니다. Eg5-mCherry의 발현을 유도하기 위해, 최종 농도가 500 µM이 되도록 황산구리를 첨가합니다. 접시를 Parafilm으로 밀봉하고 25 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

미리 준비한 22 millimeter by 22 millimeter 크기의 Concanavalin A 코팅 커버슬립을 깨끗한 35 millimeter 조직 배양 접시에 넣습니다. 그다지 100% confluency에 도달한 유도 세포 500 microliters를 커버슬립 위에 파종하고, 상온에서 세포가 부착되도록 둡니다. Eg5-mCherry 발현을 확인하려면, 배지와 함께 커버슬립을 rose chamber에 조립하고 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 형광 현미경을 사용하여 상온에서 이미징합니다.

세포가 Eg5-mCherry와 GFP alpha tubulin을 모두 발현하는지 확인한 후, 형질전환되었으나 유도되지 않은 나머지 세포를 4 mL의 Schneider's medium이 담긴 25 cm² 조직 배양 플라스크로 옮깁니다. 플라스크에 Blasticidin S HCL을 최종 농도 25 µg/mL가 되도록 첨가하고, 세포 사멸이 멈출 때까지 Blasticidin S HCL 존재 하에 세포 분할을 계속합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 KLP61F 이중 가닥 RNA를 준비한 후, Eg5-mCherry를 발현하는 S2 세포를 35 mm 배양 접시에 25% 합류도로 분주하고, 1시간 동안 부착시킵니다.

디쉬에서 배지를 제거하고 5 µg의 이중 가닥 KLP61F RNA에 serum-free Schneider's medium 1 mL를 첨가합니다. 상온에서 1시간 동안 배양한 후, 10% FBS가 포함된 Schneider's medium 1 mL를 첨가합니다. 세포를 25 °C에서 배양합니다.

dsRNA 처리 24시간 후, 최종 농도가 500 micromolar가 되도록 황산구리를 첨가하여 Eg5-mCherry의 발현을 유도합니다. 세포를 25 degrees Celsius에서 24시간 동안 추가로 배양합니다. 살아있는 세포 이미징을 수행하려면, 깨끗한 35 millimeter 조직 배양 접시에 22 millimeter by 22 millimeter 크기의 Concanavalin A 코팅 커버슬립을 넣습니다.

하룻밤 동안 유도된 dsRNA 처리 세포 500 µL를 커버슬립에 접종하고, 약 1시간 동안 부착시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 양극성 방추사의 타임랩스 이미지를 수집한 후, 로즈 챔버에서 배지를 제거하고 1 µM STLC가 포함된 Schneider 배지를 추가합니다. 방추사 붕괴를 관찰하기 위해 STLC 배지를 두 번 더 교체하며, 각 세척 단계 후 배지를 버립니다. 약물을 세척하여 방추사 붕괴를 되돌리려면, 로즈 챔버에서 STLC 함유 배지를 조심스럽게 제거하여 폐기 용기에 버리고, 총 6~8 mm의 Schneider 배지를 사용하여 세포를 4회 세척하며 각 세척 후 배지를 버립니다.

그 후 챔버를 채우기 위해 새 배지를 추가하고 이미징을 계속합니다. 약물 세척 및 워시아웃을 위해 배지에 접근하려면, 현미경에 고정된 상태에서 rose 챔버의 상단 커버슬립을 조심스럽게 제거하십시오. 또는 커버슬립과 유사하게 Concanavalin A로 처리된 유리 바닥 페트리 접시를 사용하여 살아있는 세포 이미징을 수행할 수 있습니다.

KLP61F dsRNA로 처리한 S2 세포 500 µL를 Concanavalin A 커버슬립에 파종하고 세포가 부착될 때까지 기다린 후, Schneider's medium 1.5 mL를 추가하여 최종 부피를 2 mL로 맞춥니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포가 유사분열 단계에서 정지되면, 1 µM STLC를 추가하고 1시간 동안 배양하여 모노폴(monopole)이 형성되도록 합니다. 2 mL의 신선한 Schneider's medium을 사용하여 커버슬립을 3회 세척함으로써 STLC를 제거합니다.

양극성 방추사 형성의 서로 다른 시점에서 세포를 고정하고 kinetochore 부착 부위를 평가하려면, 먼저 2 mL의 1X BRB80을 사용하여 커버슬립을 빠르게 세척하십시오. 화학 흄후드 내에서 1X BRB80에 희석된 10% PFA 2 mL를 첨가하고 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포를 투과성 있게 만들기 위해 1X PBS에 희석된 1% Triton X를 첨가하고 10분 동안 배양하십시오.

그 다음, 1X PBS에 희석된 0.1% Triton X 2 mL를 사용하여 세포를 3회 세척합니다. 이어서 커버슬립의 세포 면이 위를 향하도록 150 mm 페트리 접시 안의 파라필름 시트 위에 옮깁니다. 커버슬립에 끓인 당나귀 혈청(Boiled Donkey Serum, BDS) 150 µL를 첨가하고, 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후, 블록을 제거하고 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 1차 항체 150 µL를 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 커버슬립을 3회 세척한 후, BDS에 희석한 Fluoro-4 접합 2차 항체를 첨가하고 상온에서 30~60분 동안 배양합니다. 커버슬립을 3회 세척한 후, 1 µg/mL의 DAPI가 포함된 BDS 150 µL와 함께 5분 동안 배양합니다.

그 후 커버슬립을 두 번 세척하고, 8 µL의 마운팅 용액을 사용하여 샘플의 세포 면이 아래로 향하게 하여 3x1인치 슬라이드 위에 마운팅합니다. 매니큐어를 사용하여 모서리 부분을 고정합니다. 마지막으로 100X 대물렌즈를 사용하여 Eg5-mCherry가 발현된 양극성 방추사를 가진 세포를 이미지화합니다.

모든 채널에서 0.2 µm 간격으로 30개의 평면으로 구성된 Z-stack 이미지를 촬영하십시오. 부착 상태를 결정하기 위해 키네토코어(kinetochore)와 미세소관을 주의 깊게 분석하십시오. Drosophila S2 세포에서 양극성 방추사를 형성하는 데는 KLP61F가 필요하지만, 저분자 Kinesin-5 억제제는 이에 효과가 없습니다.

이 이미지들은 인간 Kinesin-5 Eg5가 Drosophila S2 세포에서 KLP61F의 기능을 회복시킬 수 있음을 보여줍니다. Kinesin-5 억제제인 STLC를 첨가하면, 모터 단백질의 미세소관 결합 수준이 감소하고 방추사가 붕괴되어, RNAi 결과로 내인성 KLP61F가 결핍된 세포에서 단극성 방추사가 형성됩니다. 이 그림은 Kinesin-5 억제가 약물을 세척함으로써 되돌려질 수 있으며, 양극성 방추사의 회복 과정을 시간에 따라 관찰할 수 있음을 입증합니다. 억제제를 제거하면 Eg5-mCherry가 다시 미세소관과 결합하며, 세포는 양극성 후기로 진행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 Kinesin-5의 저분자 억제제에 민감한 초파리(Drosophila) S2 세포주를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙달된 경우, 적절히 수행한다면 이 기술은 약 6시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 며칠 전부터 사전 준비가 필요하므로 미리 계획을 세우는 것이 중요합니다.

저분자 억제제를 사용할 때는 위험할 수 있으므로 항상 장갑을 착용해야 함을 잊지 마십시오. 인간화된 초파리 세포 구축은 Crispr-Cas 9 기술을 적용하여 Drosophila Kinesin-5를 인간의 상응 단백질로 대체함으로써 입증될 수 있습니다. 인간화된 Drosophila 세포의 개발은 향후 오류 수정 및 기타 필수적인 세포 과정에 대한 우리의 이해를 증진시킬 것입니다.