Herstellung von humanen Noroviren hervorstehendem Domains in E. coli Für Röntgenkristallographie

Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist die Herstellung und Reinigung der humanen Norovirus-hervorstehenden Domäne in E.coli, um extrem reines Protein für die Röntgenkristallographie zu erhalten. Unser Protokoll für die Proteinexpression, -reinigung und -kristallisation ist schnell, robust und kann für strukturelle und nicht-strukturelle Proteine verwendet werden. Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass unsere Proteine sehr rein sind und Kristalle bilden können, die mit hoher Auflösung beugen können.

Nach unserer Erfahrung muss das Protokoll möglicherweise für weniger lösliche Proteine angepasst werden. So können beispielsweise das Wachstumsmedium oder die Wachstumstemperatur während der Proteinexpression verändert werden. Transformieren Sie zunächst einen Mikroliter des pMalc2x-Vektors, der für das Fusionsprotein der MBP-His-P-Domäne kodiert, in 15 Mikroliter kompetenter E.coli BL21-Zellen unter Verwendung eines Standardtransformationsprotokolls.

Geben Sie 600 Mikroliter SOC-Medium in die Zellen. Und das eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Die transformierten Zellen werden über Nacht bei 160 U/min und 37 Grad Celsius in 120 Milliliter LB-Ampicillin subkultiviert.

Impfen Sie neun Liter LB-Ampicillin mit der Subkultur. Züchten Sie die Zellen im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 160 U/min, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,4 bis 0,6 erreicht. Senken Sie anschließend die Temperatur für etwa eine Stunde auf 22 Grad Celsius.

Es ist wichtig, zu warten, bis die Temperatur 22 Grad Celsius erreicht, bevor mit einer geringen Menge an IPTG induziert wird, um eine Expression löslicher Proteine zu ermöglichen. Induzieren Sie die Proteinexpression mit 0,66 Millimolar IPTG. Nach der Induktion wachsen die Zellen über Nacht bei 22 Grad Celsius.

Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und frieren Sie das Zellpellet bei 20 Grad Celsius ein. Bereiten Sie Puffer vor, die für die Proteinaufreinigungsschritte aus Stammlösungen verwendet werden, wie im Textprotokoll beschrieben.

Tauen Sie das Zellpellet aus der Neun-Liter-Kultur auf und lösen Sie es in 150 Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei vier Grad Celsius auf. Beschallen Sie die Zellsuspension dreimal für zwei Minuten, um die Zellen zu zerstören. Die beschallte Zellsuspension wird zentrifugiert, um Zelltrümmer von dem Überstand zu trennen, der das exprimierte MBP-His-P-Domänenfusionsprotein enthält.

Sammle den Überstand ein und entsorge das Kügelchen. Eine 10-Milliliter-Aufschlämmung aus Nickel-NTA-Agarose-Kügelchen wird in einer Chromatographiesäule gewaschen und äquilibriert. Geben Sie die äquilibrierten Nickelkügelchen in den Überstand, der das exprimierte MBP-His-P-Domänenfusionsprotein enthält, und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit langsamer Rotation.

Nach der Inkubation wird das gesamte Nickelkügelchen-Protein-Gemisch auf eine Chromatographiesäule gegeben. Waschen Sie die Säule langsam mit jeweils fünf CVs mit 10 Millimolaren, 20 Millimolaren und 50 Millimolaren Imidazolpuffern bei vier Grad Celsius. Eluieren Sie das Fusionsprotein der MBP-His-P-Domäne mit 250 millimolaren Imidazolpuffer bei vier Grad Celsius.

Überprüfen Sie während der Elution die optische Dichte bei 280 Nanometern, um die Elution des Fusionsproteins zu überprüfen. Setzen Sie die Elution fort, bis die optische Dichte bei 280 Nanometern auf etwa 0,1 abfällt. Waschen Sie die Kügelchen bei vier Grad Celsius mit einer übermäßigen Menge von 250 millimolaren Imidazol-Puffern, gefolgt von 10 millimolaren Imidazol-Puffern.

Bewahren Sie die Kügelchen für den zweiten Reinigungsschritt auf. Überprüfen Sie das Vorhandensein des MBP-His-P-Domänenfusionsproteins mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder SDS-PAGE unter Verwendung eines 12%igen SDS-Polyacrylamidgels. Konzentrieren Sie dann das eluierte MBP-His-P-Domänenfusionsprotein auf eine Endkonzentration von etwa drei Milligramm pro Milliliter.

Die Menge an Protease, die benötigt wird, um die MPP-HIS-P-Domäne effektiv zu spalten, muss sorgfältig berechnet werden. Dies hängt von der Gesamtmenge des eluierten Fusionsproteins und vom SDS-PAGE-Ergebnis ab. Spaltung der MBP-His-P-Domänenfusion mit HRV 3C-Protease während der Dialyse gegen zwei Liter 10 millimolaren Imidazolpuffer über Nacht bei vier Grad Celsius.

Abhängig vom endgültigen Volumen des konzentrierten Proteins führen Sie die Dialyse in einer Dialysekassette oder einem Dialyseschlauch durch. Die Nickelkügelchen, die in 10 milmolaren Imidazolpuffer beiseite gelegt wurden, werden äquilibriert. Inkubieren Sie das dialysierte Protein, das die gespaltene P-Domäne, das MBP-Protein und die HRV-Protease enthält, mit den äquilibrierten Nickelkügelchen für 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit langsamer Rotation.

Tragen Sie die Nickelperlenmischung auf eine Säule auf und sammeln Sie den Durchfluss bei vier Grad Celsius. Dies ist die gespaltene P-Domäne. Messen Sie die Konzentration des Proteins, wenn es aus der Säule kommt, bis die optische Dichte bei 280 Nanometern etwa 0,1 erreicht.

Das MBP-His sollte an die Nickelkügelchen gebunden bleiben und die gespaltene P-Domäne wird im Durchfluss eluiert. Überprüfen Sie das Vorhandensein einer gespaltenen P-Domäne mit SDS-PAGE mit einem 12%-Gel wie zuvor. Nach der Konzentration der eluierten P-Domäne auf etwa drei Milligramm pro Milliliter wird über Nacht bei vier Grad Celsius gegen Gelfiltrationspuffer dialysiert, um die anschließende Aufreinigung der Größenausschlusschromatographie durchzuführen.

Waschen Sie die Pumpen und Rohrleitungen des Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Reinigungssystems und äquilibrieren Sie die Größenausschlusschromatographiesäule mit Gelfiltrationspuffer. Die P-Domäne wird mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute mit einem Superloop oder einer Schleife auf die Säule injiziert, abhängig vom Volumen der konzentrierten Probe. Erhöhen Sie nach Beendigung der Injektion die Durchflussmenge auf 2,5 Milliliter pro Minute.

Wenn die optische Dichte zunimmt und sich die P-Domäne von der Säule löst, sammeln Sie Fraktionen von 1,5 Millilitern. Die P-Domäne wird normalerweise als Dimer eluiert. Nach der Überprüfung der Fraktionen mit SDS-PAGE mit einem 12%igen Gel werden nur die reinsten Fraktionen gepoolt und auf etwa drei Milligramm pro Milliliter und etwa acht Milligramm pro Milliliter konzentriert.

Verwenden Sie die P-Domäne bei etwa drei Milligramm pro Milliliter und acht Milligramm pro Milliliter für das erste Kristallisationsscreening. Bereiten Sie mindestens 100 Mikroliter P-Domäne pro Konzentration für erste Screenings mit 384 kommerziell erhältlichen Screening-Bedingungen vor. Führen Sie das Screening bei 18 Grad Celsius in einem 96-Well-Plattenformat durch, bei dem das Reservoir 100 Mikroliter Mutterlösung enthält und ein Tropfen aus 0,2 Mikrolitern Mutterlösung und 0,2 Mikrolitern Protein besteht.

Optimieren Sie die erfolgreichen Kristallisationsbedingungen mit 15-Well-Platten mit drei Reihen. Verwenden Sie 500 Mikroliter Mutterlösung als Reservoirvolumen. Richten Sie die erste Zeile mit der 100 %-Mutterlösung ein.

Die zweite Reihe mit 90% Mutterlösung und 10% Wasser. Und die dritte Reihe mit 80 % Mutterlösung und 20 % Wasser. Richten Sie den hängenden Tropfen mit einer Tropfengröße von zwei Mikrolitern ein, indem Sie ein gleiches Volumen aus Protein und Mutterlösung mischen.

Verwenden Sie die optimierten Kristallbedingungen für die Co-Kristallisation der P-Domäne mit Liganden. Bereiten Sie die Platten wie zuvor vor, aber anstelle einer Tropfengröße von zwei Mikrolitern Tropfen mit einem Mikroliter Mutterlösung, einem Mikroliter Protein und einem Mikroliter Liganden in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter aufstellen. Hier ist ein repräsentatives SDS-PAGE-Ergebnis dargestellt, das die Menge des eluierten MBP-His-P-Domänenfusionsproteins nach dem ersten Aufreinigungsschritt zeigt, bei dem das MBP-His-P-Domänenfusionsprotein mit Nickel-NTA-Agarosekügelchen aufgereinigt wird.

Nach der Trennung der MBP-His von der gespaltenen P-Domäne wird auch die Menge der eluierten gespaltenen P-Domäne mit SDS-PAGE analysiert. Nach dem letzten Reinigungsschritt mit Größenausschlusschromatographie führte das Kristallscreening zu optimierten Kristallbedingungen. Hier wird das Beugungsmuster einer hervorstehenden Domäne gezeigt.

Prinzipiell ist es möglich, Proteine in weniger als vier Wochen zu klonen, zu exprimieren, zu reinigen und zu kristallisieren, was dieses Protokoll zu einem schnellen System für die Analyse neu auftretender Norovirus-Stämme macht. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Qualität wichtiger ist als Quantität. Aufgrund der hohen Qualität der gereinigten P-Domänen sind zusätzliche Studien geeignet, darunter Immunisierungen für die Antikörperproduktion, NMR-Experimente und ELISA-basierte Studien.

Darüber hinaus kann die gereinigte P-Domäne für die Komplexbildung mit Antikörperfragmenten und Nanobodies verwendet werden. Nachdem Sie sich dieses Protokoll angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Norovirus-P-Domänen von hoher Qualität exprimiert und gereinigt werden.