subtipagem de

O objetivo geral deste procedimento de espectrometria de massas, chamado MSPP ou Filoproteômica baseada em Espectrometria de Massas, é subtipar bactérias no nível de linhagem. Este método pode ser utilizado para responder perguntas fundamentais nas áreas de Microbiologia, Epidemiologia e Higiene. Por exemplo, pode ser usado para analisar situações de surto ao visualizar a relação filoproteômica.

Em comparação com outros métodos de tipagem, o MSPP é barato por amostra e muito rápido. Infecções nosocomiais são uma questão de importância crescente, e esperamos que nosso esquema MSPP possa ser estendido para a tipagem epidemiológica de outras bactérias, ou até mesmo fungos. Nosso esquema MSPP fornece informações sobre a relação entre cepas, portanto, para a predição de fenótipos relevantes, como resistência a medicamentos ou até virulência, faz sentido aplicá-lo quando esses fenótipos se correlacionam com genótipos específicos.

Para iniciar este procedimento, prepare dois tubos de solução matriz dissolvendo 2,5 miligramas de HCCA em 250 microlitros de uma mistura de solvente orgânico, 50%isonitrila. Adicione insulina humana recombinante como padrão interno a um deles, seguido de 47,5%água bidestilada e 2,5%ácido trifluoroacético. Em seguida, espalhe uma quantidade do tamanho de uma cabeça de alfinete de uma colônia da cepa de referência diretamente sobre uma placa-alvo para MALDI.

Para determinação da massa exata do pico de calibração, coloque um microlitro do padrão de teste em outro local. Cubra cada ponto de bactéria e padrão com 1 microlitro de solução de matriz adicionada com HCCA e deixe cristalizar à temperatura ambiente. Para cada cepa a ser analisada, repita a preparação do esfregaço.

Cubra cada ponto com 1 microlitro de solução de matriz HCCA adicionada e deixe cristalizar à temperatura ambiente. Alternativamente, as proteínas podem ser extraídas de células difíceis de lisar. Para isso, colete aproximadamente 5 colônias de um cultivo em placa de ágar com um alça de inoculação.

Suspenda-os em 300 microlitros de água destilada duplamente em um tubo de reação de 1,5 mililitro e misture bem por pipetagem repetida até que as colônias bacterianas estejam completamente suspensas. Em seguida, adicione 900 microlitros de etanol absoluto e misture. Centrifugue a amostra a 13.000 g por 1 minuto.

Após secar o pellet, re-suspenda-o pipetando para cima e para baixo em 50 microlitros de ácido fórmico 70%. Em seguida, adicione 50 microlitros de acetonitrila e misture. Remova os detritos por centrifugação a 13.000 g por 2 minutos.

Quando finalizado, transfira 1 microlitro do sobrenadante para uma posição de amostra em uma placa alvo para MALDI. Após deixar a amostra secar, recubra cada ponto com 1 microlitro de solução da matriz HCCA e deixe cristalizar à temperatura ambiente. Neste momento, realize a análise por MALDI-TOF coletando 600 espectros em etapas de 100 disparos para cada ponto.

Primeiro, clique na aba de execução automática no software de configuração do espectrômetro de massas. Abra o método clicando com o botão esquerdo do mouse no botão de método e escolhendo o método no menu suspenso. Em seguida, clique com o botão esquerdo do mouse no botão editar para abrir o editor de método de execução automática.

Na guia acumulação, defina o valor de disparos satisfatório como 100 e o valor de soma como 600. Para cada espectro, escolha o pico do calibrante a partir da lista, clique em 'atribuir automaticamente' e pressione 'OK'. Após obter os espectros de massa de cada ponto, determine experimentalmente a massa exata do pico de calibração, abrindo um espectro com o navegador de espectros e identificando o pico na massa esperada em comparação com um espectro sem calibrante. Verifique se o pico do calibrante não está encoberto por qualquer outro biomarcador do organismo de interesse.

A partir dos dados de sequenciamento genômico da linhagem de referência, calcule o peso molecular monoisotópico teórico de cada uma das proteínas codificadas traduzindo a sequência de DNA na sequência de aminoácidos correspondente. Faça o upload do arquivo ou copie e cole a sequência proteica na caixa de entrada do painel do recurso bioinformático apropriado e calcule o ponto isoelétrico teórico e o peso molecular. Copie os resultados para uma planilha com uma coluna contendo o identificador do gene e outra coluna com o peso molecular.

Ordene as linhas pelo peso molecular calculado, para facilitar a consulta das massas. Insira uma coluna adicional na planilha para o peso molecular da forma desmetanada, subtraindo 135 dáltons do peso molecular mono-isotópico. Atribua cada massa principal de biomarcador medida às massas calculadas da cepa de referência, consultando a massa medida na tabela genômica.

Em outra planilha, registre a massa e o identificador para cada íon biomarcador. Agora, calibre os espectros de massa obtidos a partir dos isolados coletados, da mesma forma que foi feito para a cepa de referência. Para um isolado por linha, identifique biomarcadores variantes nos espectros de massa, registre a massa medida para cada biomarcador e o isoforma previsto nas colunas respectivas.

O espectro de massa MALDI-TOF de C-Jejuni Subspécie doylei ATCC 49349 contém 14 íons biomarcadores com carga simples que puderam ser identificados pela comparação das massas moleculares calculadas com o espectro de referência. Na coleção, foram detectadas formas iso variáveis para L32 sem metionina, L33 e a proteína hipotética codificada por gil152939117, S20 M e S15 M. As massas restantes atribuídas aos íons biomarcadores foram invariáveis nos isolados testados. A substituição de aminoácidos correspondente à mudança de massa foi identificada por amplificação PCR e sequenciamento Sanger do gene específico utilizando os iniciadores listados aqui.

As sequências de aminoácidos de todos os íons biomarcadores incluídos no esquema MSPP, bem como as isoformas alélicas detectadas, estão indicadas aqui. A dendrograma UPGMA baseado em MLST, construído a partir dos isolados examinados de C jejuni subsp. doylei, mostra que cada isolado pertence a um tipo de sequência MLST diferente. E a cepa LMG7790 apresenta a maior distância filogenética.

Como observado na análise de MLST, o isolado LMG7790 apresenta a maior distância filoproteômica na análise MSPP dos isolados examinados da subespécie C jejuni doylei. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em até um dia, se for executada corretamente. Ao seguir este procedimento, é importante lembrar da toxicidade de algumas substâncias utilizadas durante o experimento.

Por exemplo, o aceto-nitrila pode causar irritação na pele. Além disso, outros métodos como o sequenciamento de DNA podem ser realizados para analisar parâmetros adicionais, como a presença de genes de resistência. O desenvolvimento dessa técnica abre caminho para pesquisadores na área de microbiologia explorarem a fotogenia.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como o MSPP funciona e como ele pode ser aplicado a questões específicas. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos virulentos pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de equipamentos de laboratório de nível S2, devem sempre ser tomadas.