Name: Generación de un ratón humanizado hígado uso de células madre hepáticas humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprende a generar un modelo de hígado humanizado en ratones mediante trasplante de células madre hepáticas humanas. Este método permite estudiar metabolismo de fármacos y enfermedades hepáticas en un sistema in vivo funcional.

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Deseamos agradecer al Proyecto de Genética de Mamíferos, Instituto Metropolitano de Ciencias Médicas de Tokio, por proporcionar los ratones. También agradecemos a S. Aoyama e Y. Adachi del Instituto de Investigación de Toxicología y ADME (Absorción, Distribución, Metabolismo, Excreción), Sekisui Medical Company Ltd., Japón, y a K. Kozakai e Y. Yamada por su ayuda con el análisis LC-MS/MS. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón a Y-W.Z. (18591421, 20591531 y 23591872); por el proyecto innovador y empresarial de Jiangsu para la introducción de talentos de alto nivel y el proyecto de planificación de ciencia y tecnología de Jiangsu (BE2015669); y por subvenciones a H.T. para la Promoción Estratégica de la Investigación y el Desarrollo Innovadores (S-innovation, 62890004) de la Agencia de Ciencia y Tecnología del Japón.

Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices para la Protección de Animales de la Universidad de la ciudad de Yokohama. 1. Generación del modelo de lesión hepática aguda Ratón <ol><li> Añadir 1 ml de solución de NaCl al 0,85% con fenol (0,6 g de fenol en 100 ml de solución de NaCl al 0,85%) a 1 mg toxina de la difteria (DT) para hacer un ml de solución madre 1 mg / DT. Nota: DT a una concentración de 1 mg / ml se puede almacenar durante aproximadamente 2 años a 3 ° C a 8 ° C. </li><li> En serie diluir la solución de 1 mg / ml de stock DT a 0,3 g / ml DT en solución con fenol 0,85% de NaCl y preparar una alícuota de la solución de DT / ml 0,3 g como una solución de trabajo. Nota: Esta solución de trabajo debe estar recién preparado. </li><li> Para llevar a cabo experimentos utilizando una dosis subletal (~ 50% de letalidad), administrar ratones de 8 semanas de edad, una dosis / kg 1,5 g de DT. <ol><li> Realizar una inyección intraperitoneal de DT Manteniendo el ratón en decúbito dorsal e inserte el needle por debajo de la curva de las rodillas, hacia la izquierda o derecha de la línea media. Evitar la línea media para evitar la penetración de la vejiga. Ángulo de la aguja en aproximadamente 45 ° con respecto al cuerpo. </li><li> Usando una jeringa de insulina, inyectar a los ratones con 100 l de recién preparada 0,3 g DT / ml por 20 g de peso del ratón. Por ejemplo, un joven de 18 g de ratón debe recibir 90 l de la disolución de TD / ml 0,3 mg. </li></ol></li><li> Después de la inyección DT 48 hr, recoger la sangre de la vena de la cola mediante la colocación el ratón en un retenedor y el calentamiento de la cola de ratón en un baño de agua a 37 ° durante aproximadamente 10 min para dilatar los vasos sanguíneos. Luego, haga una de 1 mm incisión en la cola de 2 cm de la punta con una hoja de bisturí afilado y recoger la sangre con un tubo capilar se. <ol><li> Centrifugar el tubo microcapilar que contiene la sangre a 1.500 xg durante 5 min y se recoge el suero, separando el sobrenadante y las células de pellets. </li></ol></li><li> Pipeta de 50 l de suero de ratón 1:20 diluida sobre GOT / AST-PIII se desliza. Se mide la absorbancia del producto de reacción (colorante azul) en 650 nm usando un analizador de química seca automático multiusos según el protocolo del fabricante. NOTA: La lectura de la aspartato aminotransferasa (AST) / actividad transaminasa glutámico oxalacético (GOT) se muestra automáticamente. 2 días después de la inyección de DT, aproximadamente el 60% de los ratones exhibieron valores de AST entre 12.000 - 16.000 UI / L y se considera que sufre de daño hepático agudo. Estos ratones se transfirieron a una nueva jaula y se utilizan como receptores de trasplante celular. </li></ol> 2. Preparación de las células madre hepáticas humanas <ol><li> Aislar células madre hepáticas humanas a partir de células de hígado fetal primarios humanos con un clasificador de células usando los antígenos de las células CDCP1, CD90, CD66 y para obtener una subpoblación CD90 + CDCP1 + CD66-, a continuación, sembrar la población de células aisladas en placas de cultivo recubiertas con colágeno IV, como se informó anteriormente 15. Utilizar células de hígado fetal primarios humanos de una embrionariaedad entre 14 y 18 semanas. </li><li> Recoger las células madre hepáticas humanas cultivadas a 80% - 90% de confluencia en placas de cultivo de 100 mm, aspirar el medio de cultivo, se lavan las células con 10 ml de PBS, y luego retirar el PBS. Tripsinizar las células con solución de tripsina / EDTA 2 ml 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Nota: Las células en más de un 90% de confluencia no son adecuados para el trasplante de células ya que la diferenciación de células puede influir en su capacidad proliferativa en ratones. </li><li> Supervisar el estado de dispersión de las células bajo un microscopio. Cuando las células parecen estar flotando o que fluye libremente, detener la digestión enzimática mediante la adición de 8 ml de DMEM / F12 que contiene 10% de FBS. </li><li> Suspender las células lentamente usando una pipeta serológica de 10 ml y la transferencia de las células en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células durante 5 minutos a 100 x g y 4 ° C. </li><li> resuspender cuidadosamente el sedimento celular en 10 ml de DMEM / F12 que contiene 10% de FBS y determinar el número de células usando una cámara del microscopio contando. </li><li>Dividir las células en 1,0 x 10 6 células por 50 l de PBS alícuotas para cada ratón individual y almacenar en hielo hasta el trasplante. </li></ol> 3. intraesplénicos trasplante de células madre hepáticas humanas <ol><li> Colocar una jaula limpia en un 37 ° C almohadilla eléctrica. </li><li> Anestesiar al ratón usando isoflurano inhalación (1 a 1,5% (vol / vol) en 2 L de oxígeno por min) colocándolo debajo de la boquilla. Alternativamente, utilizar tubos que contienen una gasa empapada con isoflurano. <ol><li> Asegúrese de que el ratón se anestesia pellizcando suavemente la almohadilla de la pata trasera. Si se provoca un reflejo de la rodilla, coloque el ratón de nuevo en la cámara. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. </li></ol></li><li> Afeitar el sitio quirúrgico usando una maquinilla eléctrica y aplicar el 70% (/ vol vol) de etanol y povidona yodada para esterilizar. A continuación, hacer una incisión en la piel de 1 cm en el flanco izquierdo justo por debajo del reborde costal de las costillas, seguido de una incisión enla pared abdominal, así como el peritoneo. </li><li> Descubra con cuidado el bazo. Utilice una jeringa microinyección de 100 l con un 32-G de aguja 1/2-pulgada para inyectar directamente 1,0 x 10 6 células madre hepáticas humanas en 50 l de PBS en el bazo de cada ratón. Inclinar la aguja en un ángulo de 5 ° para inyección. <ol><li> Asegúrese de que la profundidad de la inyección es menor que la mitad del espesor del bazo. La aguja debe entrar en el bazo en un extremo (la cabeza) y depositar las células en el otro extremo (la cola). </li></ol></li><li> Para evitar fugas de las células después de la inyección, aplicar una suave presión con el dedo durante 2 minutos y luego retirar la aguja. </li><li> Coloque el bazo de nuevo en el cuerpo del ratón y cerrar la cavidad con una sutura continua normal para la musculatura y la piel. </li><li> La transferencia de los ratones en una jaula de 37 ° C pre-calentado inmediatamente después del trasplante. Para garantizar el ratón es capaz de respirar sin dificultad, colocar el ratón sobre su lado en la jaula, unamiccional contacto entre la ropa de cama de la jaula y el sitio de la cirugía. </li><li> Monitorear los ratones hasta que el efecto de la anestesia para asegurar las suturas permanecen cerrados y los ratones de regreso a las condiciones pre-cirugía. </li><li> Asegurar que los ratones se proporcionan con el agua potable normal y alimentos. Después de 1 hora, volver a la jaula para la habitación del ratón del centro de animales y controlar los ratones diariamente. </li></ol> 4. Detección de Trasplantados hepática hepatocitos humanos de células madre derivadas de células en el hígado de ratón Nota: Para los siguientes procedimientos, la eutanasia a todos los animales utilizando una sobredosis de ketamina y xilazina seguido por dislocación cervical. <ol><li> A los 4 - 6 semanas después del trasplante, la eutanasia a los ratones y abrir la cavidad abdominal mediante la reducción simultánea del cutis y la fascia utilizando tijeras quirúrgicas. </li><li> Diseccionar el tejido conectivo por encima del peritoneo, con las tijeras como un esparcidor, y cortar el peritoneo a lo largo de la línea alba para abrir el peritonealcavidad. </li><li> Levantar el esternón con fórceps, perforar el diafragma, y ​​cortar a través de cada lado del esternón a través de la faja cervical. </li><li> Cortar la vena cava en el lado dorsal del hígado y tire del esófago a través del hígado en la dirección anterior. Retire el diafragma a fin de eliminar el hígado. Nota: Tenga cuidado de mantener la punta de las tijeras apuntando hacia arriba con el fin de evitar cualquier daño a los órganos torácicos debajo. El timo tiene una tendencia a aferrarse de vez en cuando en el lado dorsal del esternón y esto debe evitarse cuidadosamente. </li><li> El uso de la membrana como un mango, empezar a tirar el hígado fuera de la cavidad abdominal. La vena cava interior estará llevando a cabo el hígado en su lugar. Cortar el interior de la vena cava; tener cuidado de no liberar prematuramente la suprarrenal derecha. Nota: Los ratones tienen un hígado de cuatro lóbulos que consiste en un lóbulo medio, lóbulo izquierdo, lóbulo derecho y el lóbulo caudado. La vesícula biliar se suspende en la pequeña bifurcación deel lóbulo medio. </li><li> Separar los lóbulos de uno al otro en las uniones e integrarlos en el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Congelar los PTU que contiene el tejido hepático en las rejillas de metal en el criostato. </li><li> Cortar secciones de la muestra de 5 micras de grosor usando un criostato a -18 ° C y montarlos en portaobjetos de microscopio RT. Guarde el archivo a -80 ° C. Preparar los portaobjetos para hematoxilina y eosina (H &amp; E) y tinción de inmunofluorescencia de acuerdo con procedimientos previamente reportados 16. </li></ol> 5. Detección de Albúmina Humana secreción y cálculo de la tasa quimérico <ol><li> Para medir la reconstitución de hígado humano, realizar albúmina humana ELISA utilizando suero y una albúmina ELISA kit humano de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Calcular la tasa de hígado quimérico humanizado por tiempo real PCR análisis de los niveles de expresión en todo el hígado humanizado. Determinar el ex relativarelación de nivel pression de actina humano específico para cruz actina humano-ratón (relación 1) y la relación de actina de ratón específico para cruz actina humano-ratón (relación 2). La tasa quimérico se calcula como cociente / 1 (relación 1 + relación de 2). </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que divulgar.

Estudios recientes han demostrado que el hígado de ratón se puede repoblada con hepatocitos humanos, incluidos los hepatocitos adultos y células madre hepáticas proliferativas 17. Estos hígados repobladas han sido utilizados como modelos experimentales preclínicos para las pruebas de metabolismo de fármacos y el descubrimiento y el desarrollo 18 de drogas; Además, han proporcionado un entorno in vivo para la maduración y la diferenciación celular 19. El principal objetivo del pr...

Los ratones se utilizan comúnmente para las pruebas farmacéuticas ya que la investigación biomédica en humanos está restringida1; sin embargo, estos modelos no siempre son útiles ya que pueden simular incorrectamente los efectos observados en los humanos. La mayoría de los medicamentos de uso médico actual se metabolizan principalmente en el hígado. Sin embargo, el mismo fármaco puede metabolizarse en diferentes metabolitos en el hígado de ratón y humano debido a las diferencias entre especies. Por lo tanto, a menudo es difícil determinar durante el desarrollo si un fármaco potencial presenta algún riesgo para las aplicaciones clínicas2,3. 
Para abordar este problema, se han desarrollado hígados de ratón "humanizados" mediante el cultivo de células hepáticas humanas dentrode ratones 4-6; estos modelos exhiben respuestas a fármacos similares a las observadas en el hígado humano. Los modelos de ratón primarios que se utilizan actualmente para la generación de hígado humanizado incluyen los ratones activadores del uroplasminógeno (uPA+/+)4,7, los ratones fumarialacetoacetato hidrolasa (Fah-/-)6 y los ratones timidina quinasa (TK-NOG) recientemente reportados. 
Sin embargo, informes previos han demostrado que las células inmaduras humanas trasplantadas o las células madre son menos competitivas que los hepatocitos humanos adultos en hígados de ratón Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−)8-10. Además, los ratones Fah−/− proporcionan una ventaja de crecimiento solo para los hepatocitos diferenciados y no para las células progenitoras hepáticas inmaduras11. El trasplante de células madre hepáticas humanas (HpSC) en ratones TK-NOG en el laboratorio no ha tenido éxito. Por lo tanto, actualmente no existe un modelo de ratón útil para el injerto eficiente de células hepáticas inmaduras humanas. 
Por lo tanto, desarrollamos un nuevo modelo de ratón Alb-TRECK/SCID que podría repoblarse de manera eficiente con hepatocitos inmaduros humanos. Este modelo de ratón transgénico expresa receptores del factor de crecimiento similar al EGF de unión a heparina humana (HB-EGF) bajo el control de un promotor de albúmina específico de las células hepáticas. Después de la administración de toxina diftérica (DT), estos ratones desarrollan hepatitis fulminante debido a la ablación condicional de los hepatocitos, lo que permite la residencia y proliferación de las células del donante12. A pesar de que los hepatocitos de ratón han sido trasplantados con éxito en ratones Alb-TRECK/SCID en estudios previos13,14, la generación de un hígado humanizado utilizando ratones Alb-TRECK/SCID aún no ha sido reportada. 
En este estudio, se generaron hígados humanizados en ratones Alb-TRECK/SCID mediante trasplante de HpSCs. Este hígado humanizado proporciona un entorno in vivo para la diferenciación universal de células madre y la capacidad de predecir los patrones del metabolismo de los fármacos humanos y las interacciones entre fármacos.

<table><tbody><tr><td>Albúmina humana</td><td>Sigma</td><td>A6684</td><td>Ratón</td></tr><tr><td>Humano CK19</td><td>Dako</td><td>M088801</td><td>Ratón</td></tr><tr><td>Núcleos humanos</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Ratón</td></tr><tr><td>humano CK8/18</td><td>Progen</td><td>GP11</td><td>Conejillo de indias</td></tr><tr><td>CDCP1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>324006 Ratón</td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>559869</td><td>Ratón</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>551479</td><td>Ratón</td></tr><tr><td>GOT/AST-PIII</td><td>Fujifilm</td><td>14A2X10004000009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Toxina Diftérica</td><td>Sigma</td><td>D0564-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Humana ELISA Kit</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa (1 ml)</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>32G Aguja de 1/2"</td><td>TSK</td><td>PRE-32013</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compuesto(118 ml)</td><td>Sakura Finetek Japón</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador de celdas de alta velocidad MoFlo</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>DRI-CHEM 7000</td><td>Fujifilm</td><td>14B2X10002000046</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de un ratón humanizado hígado uso de células madre hepáticas humanas

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Se ha desarrollado un nuevo modelo animal que involucra ratones quiméricos con hígados humanizados establecido mediante trasplante de hepatocitos humanos. Estos ratones, en los que el hígado ha sido repoblado con hepatocitos humanos funcionales, podrían servir como una herramienta útil para investigar la biología de las células hepáticas humanas, el metabolismo de los fármacos y otras aplicaciones preclínicas. Uno de los factores clave necesarios para el éxito del trasplante de hepatocitos humanos a ratones es la eliminación de los hepatocitos endógenos para evitar la competencia con las células humanas y proporcionar un espacio y un microambiente adecuados para promover la expansión y diferenciación de las células del donante humano. Hasta la fecha, se han establecido dos modelos de ratones con lesiones hepáticas importantes que utilizan lacaretoacetato de fumario hidrolasa (Fah) y ratones activadores del uroplasminógeno (uPA). Sin embargo, los ratones Fah se utilizan principalmente con hepatocitos maduros y la aplicación del modelo uPA está limitada por la disminución de la reproducción. Para superar estas limitaciones, se utilizaron ratones knockout celular mediado por el receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID para la diferenciación in vivo de hepatocitos humanos inmaduros y la generación de hígado humanizado. Las células madre hepáticas humanas (HpSC) repoblaron con éxito los hígados de ratones Alb-TRECK/SCID que habían desarrollado una insuficiencia hepática fulminante letal después del tratamiento con toxina diftérica (DT). Este modelo de hígado humanizado en ratones Alb-TRECK/SCID tendrá aplicaciones funcionales en estudios relacionados con el metabolismo de fármacos y las interacciones entre fármacos, y promoverá otros estudios in vivo e in vitro.

Alb-Treck / hepatocitos ratones SCID expresan el receptor de DT gen HB-EGF humano bajo el control de un promotor de albúmina y exhiben efectos citotóxicos después de la administración DT 12. Para evaluar los efectos del tratamiento DT sobre la lesión hepática, dosis de DT de 1,5 g / kg se inyectaron en ratones SCID de 8 semanas de edad, Alb-Treck / y los cambios patológicos en la administración DT h después de hígado 48 fueron evaluados histológicamente. En comparación con los...

Aquí, presentamos un nuevo modelo de hígado de ratón humanizado generado en ratones knockout celular mediado por el receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID tras el trasplante de células madre hepáticas humanas inmaduras y expandibles.

Generación de un ratón humanizado hígado uso de células madre hepáticas humanas

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

El objetivo general de este procedimiento quirúrgico de trasplante de células madre es generar un nuevo modelo de ratón quimérico con función hepática humana, utilizando células progenitoras inmaduras hepáticas humanas que permitan la proliferación, maduración y diferenciación celular para adquirir metabolismo de fármacos. Este método proporciona una herramienta poderosa para crear un microentorno que apoye la progénesis de células madre hepáticas donantes humanas, permitiendo su expansión, diferenciación y reconstrucción del hígado lesionado del ratón receptor. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden utilizar células proliferadas y maduras, y que el hígado se repobla casi por completo.Para comenzar, prepare una solución stock de toxina diftérica o DT de un miligramo por mililitro agregando un mililitro de solución fenolizada de cloruro de sodio al 0,85 % a un miligramo de DT. Realice una inyección intraperitoneal de DT sujetando un ratón scid albtrek en posición recostada dorsalmente y debajo de la curvatura de las rodillas, a la izquierda o derecha de la línea media, e inserte la aguja en un ángulo de 45 grados respecto al cuerpo. Utilizando una jeringa de insulina, inyecte 100 microlitros de una solución recién preparada de 0,3 microgramos por mililitro de DT por cada ratón de 20 gramos. A las 48 horas posteriores a la inyección de DT, coloque al ratón en un sujetador y caliente la cola en un baño de agua a 30 grados Celsius durante aproximadamente 10 minutos para dilatar los vasos sanguíneos.Luego, a dos centímetros de la punta de la cola, use una hoja de bisturí afilada para hacer un corte de un milímetro de profundidad en la cola y use un tubo capilar para recolectar la sangre. Centrifugue el tubo microcapilar que contiene la sangre a 1500 ×g durante cinco minutos y recolecte el suero separando el sobrenadante del botón celular. Pipetee 50 microlitros de una dilución uno a veinte del suero sobre portaobjetos GOT ASTP3.Luego, utilizando un analizador automático multifuncional de química seca según el protocolo del fabricante, mida la absorbancia del producto de reacción a 650 nanómetros. Mediante un clasificador celular, aísle células madre hepáticas humanas a partir de células hepáticas fetales primarias humanas utilizando los antígenos celulares CDCP1, CD90 y CD66 para obtener una subpoblación positiva para CDCP1, positiva para CD90 y negativa para CD66. Siembre las células en placas de cultivo con código de colágeno IV e incube a 37 grados Celsius.Cuando las células alcancen una confluencia del 80 al 90 %, lávelas una vez con PBS. A continuación, agregue tripsina-EDTA al 0,05 % e incube a temperatura ambiente. Cuando las células parezcan estar flotando o moviéndose libremente bajo el microscopio, detenga la digestión enzimática agregando ocho mililitros de DMEM-F12 que contenga 10 % de suero bovino fetal.Con una pipeta serológica de 10 mililitros, suspenda lentamente las células antes de transferirlas a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue las células a 100 veces G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Utilizando 10 mililitros de DMEM/F12 con 10 % de SFB, resuspenda cuidadosamente el sedimento celular y use un instrumento de conteo celular para determinar el número de células.Divida las células en alícuotas de uno por diez a la sexta células por 50 microlitros de PBS para cada ratón y almacénelas en hielo hasta el trasplante. Después de anestesiar un ratón según el protocolo descrito en el texto, verifique un reflejo pellizcando ligeramente la almohadilla del pie trasero. Luego, aplique pomada veterinaria en los ojos para prevenir la sequedad.Con afeitadoras eléctricas, afeite el sitio quirúrgico y aplique etanol al 70% y povidona-yodo para desinfectar. Realice una incisión cutánea de un centímetro en el flanco izquierdo justo debajo del borde costal de las costillas. Luego, realice una incisión en la pared abdominal izquierda seguida de una incisión en el peritoneo.A continuación, exponga cuidadosamente el bazo. Luego, inserte un microjeringa de 100 microlitros con una aguja de calibre 32 y media pulgada a un ángulo de cinco grados, a una profundidad de la mitad del grosor del bazo, e inyecte directamente, de un extremo a otro del órgano, una vez 10 a la sexta células madre hepáticas humanas en 50 microlitros de PBS en el órgano y retire la aguja. Para prevenir la fuga de las células tras la inyección, use un dedo para aplicar suavemente presión durante dos minutos.Coloque el bazo nuevamente en el cuerpo del ratón y use un punto continuo normal para la musculatura y la piel con el fin de cerrar la cavidad. Transfiera inmediatamente al ratón de lado a una jaula precalentada a 37 grados Celsius. Evite el contacto entre el material de cama de la jaula y el sitio de la cirugía, y supervise al animal según el protocolo descrito en el texto.A las cuatro a seis semanas posteriores al trasplante, tras sacrificar el ratón según el protocolo descrito, use tijeras quirúrgicas para abrir la cavidad abdominal cortando simultáneamente la piel y la fascia. Utilizando las tijeras como separador, disecar el tejido conectivo por encima del peritoneo a lo largo de la línea alba para abrir la cavidad peritoneal. Con pinzas, levante el esternón.Luego punce el diafragma y corte por cada lado del esternón hasta el cinturón cervical. Seccione la vena cava en el lado torácico del hígado y tire del esófago a través del hígado en dirección anterior. Retire el diafragma y luego, utilizando este como asa, comience a extraer el hígado de la cavidad abdominal.La vena cava inferior mantendrá el hígado en su lugar. Por lo tanto, corte la vena cava inferior teniendo cuidado de no liberar prematuramente la glándula suprarrenal derecha. Separe los lóbulos del hígado entre sí en las uniones e incruste los lóbulos en OCT según el protocolo del fabricante.Congele la OCT que contiene el tejido hepático en las rejillas metálicas del criostato. Con el criostato, corte secciones de muestra de cinco micrómetros de grosor a menos 18 grados Celsius y colóquelas sobre portaobjetos a temperatura ambiente. Almacene el stock a menos 80 grados Celsius.Finalmente, prepare los portaobjetos para la tinción con H&E según procedimientos previamente descritos y para ELISA según el protocolo descrito en el texto. Como se muestra en estas secciones teñidas con H&E, los ratones tratados con DT exhibieron una arquitectura hepática desorganizada y mostraron una corrección de la congestión con aumento de la actividad sérica de AST. A las seis semanas posteriores al trasplante, las células derivadas de células madre hepáticas humanas reconstituyeron la estructura hepática al reemplazar los hepatocitos residentes del ratón.Macroscópicamente, a los cuatro días posteriores al trasplante, se detectaron pequeños grupos hepáticos humanos distribuidos de manera uniforme alrededor del hígado. A los 45 días, los grupos habían proliferado formando agrupaciones más grandes. Como se observa aquí, la presencia de hepatocitos humanos en hígados de ratón se confirmó por primera vez seis semanas después del trasplante mediante tinción con anticuerpos contra núcleos humanos y citokeratina 8/18.Los hepatocitos humanos positivos para ALB y negativos para CK19 se asemejaban a hepatocitos funcionales, mientras que las células que mostraron tinción positiva conjunta para ALB humano y CK19 exhibieron una capacidad bi-potencial para diferenciarse en hepatocitos y colangiocitos. Se detectó la presencia de múltiples agrupaciones redondeadas alrededor de los lóbulos hepáticos, con núcleos humanos evidentes y expresión de CK8/18, lo que demuestra la capacidad de formación de colonias de las células madre hepáticas humanas en hígados humanizados. Finalmente, el nivel de repoblación alcanzó hasta un 90 % un mes después del trasplante, y se detectó la secreción de albúmina humana en los hígados de ratón repoblados.Una vez dominada, la trasplantación quirúrgica de células puede realizarse en 10 minutos si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la lesión hepática debe restringirse al hígado lizer suple. Bajo fuga celular, debe evitarse la trasplantación de células.Combinado con este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la transfección génica para la reprogramación directa in vitro con células humanas, con el fin de explorar la convergencia de las células humanas con nuestro modelo actual. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la hepatología exploraran el metabolismo de fármacos en humanos, la interacción entre fármacos, la toxicidad hepática y el virus de la hepatitis en un modelo de hígado humanizado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y expandir la célula madre hepática, inducir lesión hepática y trasplantar una célula mediante el bazo para generar un modelo de ratón quimérico con función hepática humana.No olvide que la toxina de la difteria puede ser controlada y que son importantes precauciones como evitar la necrosis del corazón y del hígado, las cuales siempre deben tomarse al realizar este procedimiento.

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Investigación

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