Name: Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde ekstrakromozomal dairesel DNA (eccDNA) izolasyonu ve genom çapında tespiti için Circle-Seq yöntemini. Bu hassas protokol, genom stabilitesi ve evrim çalışmalarında uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardım için Kenn D. Møller ve Claus Sternberg'e (DTU) ve kantitatif PCR analizi için Tue S. Jørgensen'e teşekkürler.

Not: dairesel DNA saflaştırma ve dizileme yöntemi (daire-Seq) bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. 1. Yetiştirme, Hücre Hasat ve Plazma Membran bozulması <ol><li> Maya Pepton Dekstroz, 50 ml tam bir besin ortamı (YPD) içine bir O / N kültüründen (örneğin Saccharomyces cerevisiae), maya hücreleri inoküle. 1-3 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir düşük bir başlangıç ​​hücre yoğunluğu ya da yaklaşık olarak 0.01 OD 600 bir optik yoğunlukta inoküle. <ol><li> Hücreler, yaklaşık 24 saat veya OD 600&gt; 10.0 bir optik yoğunluk 48 sonra yaklaşık olarak 1 x 10 10 hücrelerin maksimum hücre yoğunluğu ulaşana kadar dakika (rpm), 150 mermi ajitasyon ile 30 ° C &#39;de inkübe hücreleri. NOT: düşük hücre konsantrasyonları kullanılabilir gibi kültür süresi önemli değildir. </li></ol></li><li> 50 ml konik tüp geçmek kültürü transfer santrifüj ile hücreler pelet800 xg 3 dakika ve supernatant atın. </li><li> 3 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüj ile hücreler yeniden pelet ve supernatant atın, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0 25 mi tampon solüsyonu ile pelet yıkayın. </li><li> bir plasmid sütun saflaştırma kiti temin 1.2 ml yeniden süspansiyon tamponunda hücre pelletini. </li><li> İsteğe bağlı adım: dairesel DNA elemanlarının 20 arıtılması için kontrol olarak son derece sulandırılmış plazmidler ekleyin. Not: Mevcut veri kümesinde, bir 7.7 ul plazmit karışımı 10 10 hücreleri ihtiva eden her bir örnek için uygulanmıştır. plazmid stok karışımı farklı konsantrasyonlarda üç plazmid oluşuyordu; 0.01 ng / numune 38 ng / numune de pBR322, pUC19 0.5 ng / numune de, ve pUG72. </li><li> Toplam süspansiyon hacmi: 3 oranında 2 ml iki mikro santrifüj tüplerine hücre süspansiyonu transfer her biri bir 1, 0.5 mm cam boncuklar ile takviye edilmiştir. </li><li> Plazma hücresi bozmaya 10 dakika vorteksleyin, maksimum hızda, her tüpMembranlar. 30 saniye için 268 x g&#39;de santrifüj ile boncuk pelet ve yeni bir tüpe mikrosantrfuj tübüne 1.2 mL birleştirilmiş süpernatant aktarın. Not: Alternatif 0.6 mi yeniden süspansiyon tamponu çözeltisi içinde Hücrelerin yerinden oynaması için zymolyase kullanarak, 1.6-1.7 adım. Zymolyase on adet 35 ° C&#39;de 1.5 saat içerisinde 5 x 10 7 hücre bozabilir. </li></ol> Kolon Kromatografisi 2. EccDNA Zenginleştirme <ol><li> plazmid kolon saflaştırılması için bir kit protokolü uygulayın. Kısaca, 1.2 mi alkalin çözelti ile her bir örnek tedavi yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkalayın. </li><li> 1.2 mi nötralizasyon tampon ekleme 5 dakika boyunca 9650 x g&#39;de yumuşak ve santrifüj karıştırın. </li><li> 1 mi, dengeleme çözeltisi ile dengelenmiş bir sütun üzerine çözelti yük ve sıvı yerçekimi ile sütun dolaşmasını sağlar. </li><li> 4 ml yıkama çözeltisi ile sütun yıkayın. çözelti, reçine geçtikten sonra, dikkatli bir şekilde 0.3 ml elüsyon şekilde eklemedökülmesinden 0.35 mi kolonu boş hacim çok değiştirmek için kullanılır. </li><li> 1 mi yıkama çözeltisi ile yeni bir toplama tüpüne DNA Zehir 0.8 mi çöktürme karışımı ekleyerek çökelti DNA. 10 dakika boyunca 9650 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 5 ila 15 dakika boyunca 5 dakika hava Kuru 9650 xg&#39;de 0.5 mi,% 70 etanol, santrifüj ile DNA pelet yıkayıp 25 ul steril su içinde saflaştırılmış DNA çözülür. NOT: Suda DNA sadece kısa süreli depolama tavsiye edilir. Tercihen, adım 3&#39;e doğrudan geçin. </li></ol> 3. Sindirim Doğrusal kromozomal DNA&#39;nın kalan <ol><li> İsteğe bağlı adım: ekzonükleaz ile doğrusal DNA spesifik sindirimi kolaylaştırmak gibi Notl gibi nadir kesici endonükleaz ile saflaştırılmış DNA tedavisi için. 5 ug DNA için, 50 ul toplam hacim 1 birim Notl, 5 ul 10x sindirim tampon ve steril su kullanın. 16 saat ve ısı 37 ° C &#39;de reaksiyon inkübe 5 dakika boyunca 80 ° C&#39; de endonükleaz etkisiz hale getirirler. </li><li> 20 eklebirim ekzonükleaz (2 ul), 4 ul ATP (25 mM), 34 ul steril su ve 50 ul Endonükleaz&#39;a klivaj DNA&#39;ya doğrudan 10 ul 10x reaksiyon tamponu ATP-bağımlı Eksonükleaz kullanılarak 100 ul 1x reaksiyon hacmi ulaşmak kiti. </li><li> 5 gün veya daha fazla, 37 ° C de, doğrusal tek sarmallı ve çift sarmallı DNA hidrolizi gerçekleştirmek. Ek bir 4 ul ATP (25 mM), 0.6 ul 10 x reaksiyon tamponu ve 1 x reaksiyon hacmi enzimatik sindirim, DNA devam her 24 saatte egzonükleaz 20 birimleri ekleyin. </li><li> Lineer DNA çıkarılmasından sonra eksonükleaz ile muamele edilen çözelti örnek 2 ul aktin geni ACT1 20 bir kromozom işaretleyici kullanılarak niceliksel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), kromozom lineer DNA kaldırılması teyit etmek için. <ol><li> Her 20 ul qPCR reaksiyon hacmi 2 ul eksonükleaz ile muamele edilmiş numune, 150 nM ACT1 primerleri 5&#39;-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 &#39;ve 5&#39;-TGGACCACTTTCGTC içerirGTATTC-3 &#39;,% 2 (hacim / hacim) dimetil sülfoksit ve 10 | il yeşil fluoresan ana karışımı. </li><li> Reaksiyon koşulunu kullanın; 95 ° C&#39;de 15 saniye 45 döngü, 60 ° C&#39;de 30 saniye, ardından 95 ° C&#39;de 3 dakika,. NOT: Bu gen kopya sayısı değişimleri, böylece eccDNA Act1 taşıyan olmamalıdır 21-23 zararlı olduğundan ACT1 lineer DNA için özellikle uygun bir belirtecidir. </li><li> qPCR DNA parçalanması analizinde alternatifleri, standart PCR (4.3) ya da propidyum iodid koyulaştırması (4.4) vardır. <ol><li> ACT1 primerleri 5&#39;-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 &#39;ve-GAACGACGTGAGTAACACC-3 5&#39; &#39;PCR şablon olarak 2 ul eksonükleaz ile muamele edilmiş numune kullanılır. Pozitif ACT1 kontrol olarak, genomik S. ng 50-100 kullanın şablon olarak S. cerevisiae bir DNA. PCR reaksiyon koşulları; 95 ° C&#39;de, 56 ° C&#39;de 30 saniye ve 72 ° C&#39;de 1 dakika 30 saniye 35 döngü, ardından 95 ° C&#39;de 3 dakika,. </li><li> Jel electrophore Run PCR reaksiyonları0.5 ug% 1 agaroz üzerinde sis / ml etidyum bromür. 0.8 kb ACT1 bandı için arayın. </li></ol></li><li> yokluğu veya lineer DNA varlığı, önce, ve DNA amplifikasyonundan sonra, propidyum iyodür boyaması yolu ile kontrol edilebilir. <ol><li> 20 mM propidyum iyodid stokunun 1.000 H2O ile seyreltilmiş çözelti bir 1: 1 hacim: 1, her bir DNA numunesi karıştırın. Oda sıcaklığında 10-20 dakika süreyle karanlıkta çözüm bırakın ve 663-738 nm ve 5 ila 30 saniye arasında bir pozlama zamanında kırmızı uyarma floresan filtre kullanarak 100x büyütmede floresan mikroskobu ile DNA boyama analiz. DNA boyama kontrol olarak kullanımı maya ve / veya ø29 amplifikatörlü plazmid genomik DNA ø29-amplifikasyonuna tabi tutulabilir. </li></ol></li></ol></li><li> Isı 30 dakika boyunca 70 ° C&#39;de ekzonükleaz çözeltisi etkisiz hale getirirler. </li></ol> 4. DNA amplifikasyonu <ol><li> Saflaştırılmış yükseltmek ve ø29 DNA polimeraz 24-26 anlaşmanın ile adım 3.5) den eccDNA zenginleştirilmişpolimeraz, üretici protokolüne ing. <ol><li> Kısaca, 5 ul denatürasyon tamponu ile eccDNA zenginleştirilmiş 5 ul karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika sonra, 10 ul nötralizasyon tampon eklemek. İyice karıştırın ve 29 ul reaksiyon tamponu ve 1 ul ø29 DNA polimeraz içeren 30 ul ana karışımı ekleyin. (72 saat kadar), 16 saat ya da daha fazla süreyle 30 ° C &#39;de reaksiyon inkübe edin. Grup 3 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta ø29 DNA polimeraz etkisiz hale getirirler. </li></ol></li></ol> 5. Sıralama ve Veri Analizi <ol><li> 300 bp bir ortalama hedef pik boyutuna odaklanmış ultrasonikatör ile yükseltilmiş eccDNA kayma. 130 ul DNA örneği için aşağıdaki ayarları kullanın: 450W tepe yoğunluğu gücü, 60 sn tedavi,% 30 görev faktörü, patlama başına 200 devir, sıcaklık 7 ° C. </li><li> parçalanmış kütüphane hazırlanması için uygun bir yöntem kullanılarak, dizileme için kütüphanelerin sentezi için okur barkod indeksi etiketleri ve adaptörleri ekleyin. </li><li>141-nükleotid tek-uçlu yüksek verimli bir dizi platformunda okur örneğin, derin sıralama çalıştırın. </li><li> Harita soruşturma altında maya referans genomuna okur ve izin birden fazla bölgelere eşleştirmek için okur. Örneğin, bir serbestçe kullanılabilir iş akışı sistemi 27,28 ve kısa okuma hizalama haritalama yazılımı 29 kullanın. </li><li> Tespit boşlukları 20 olmadan, örneğin, birden fazla ardışık yedi okur okur bitişik (&gt; 1 kb) ile farazi eccDNAs bölgeleri okur. NOT: Yazılım kullanılabilir eşlenen keşfetmek için 27,28 ilgi genomik bölgelerde okur. </li></ol>

<ol><li>Kugelberg, E., Kofoid, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Inversion+Duplication+in+Salmonella+enterica.%3A+Selection+Drives+Unstable+Precursors+to+Final+Mutation+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Tandem Inversion Duplication in Salmonella enterica.: Selection Drives Unstable Precursors to Final Mutation Types.</a> Genetics. 185 (1), 65-80 (2010).</li>
<li>Reams, A. B., Kofoid, E., Savageau, M., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplication+Frequency+in+a+Population+of+Salmonella+enterica.+Rapidly+Approaches+Steady+State+With+or+Without+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Duplication Frequency in a Population of Salmonella enterica. Rapidly Approaches Steady State With or Without Recombination.</a> Genetics. 184 (4), 1077-1094 (2010).</li>
<li>Smith, C. A., Vinograd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+polydisperse+circular+DNA+of+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Small polydisperse circular DNA of HeLa cells.</a> Journal of Molecular Biology. 69 (2), 163-178 (1972).</li>
<li>Carroll, S. M., DeRose, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Minute+Chromosomes+Can+Be+Produced+from+Precursors+Derived+from+a+Chromosomal+Deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Double Minute Chromosomes Can Be Produced from Precursors Derived from a Chromosomal Deletion.</a> Molecular and cellular biology. 8 (4), 1525-1533 (1988).</li>
<li>Cohen, S., Yacobi, K., Segal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+Circular+DNA+of+Tandemly+Repeated+Genomic+Sequences+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal Circular DNA of Tandemly Repeated Genomic Sequences in Drosophila.</a> Genome research. 13 (6A), 1133-1145 (2003).</li>
<li>Horowitz, H., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Autonomously+Replicating+Circular+Subtelomeric+Y%27+Elements+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Autonomously Replicating Circular Subtelomeric Y' Elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and cellular biology. 5 (9), 2369-2380 (1985).</li>
<li>Moore, I. K., Martin, M. P., Dorsey, M. J., Paquin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Circular+Amplifications+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+a+Breakage-Fusion-Bridge+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+molecular+mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Formation of Circular Amplifications in Saccharomyces cerevisiae by a Breakage-Fusion-Bridge Mechanism.</a> Environmental and molecular mutagenesis. 36 (2), 113-120 (2000).</li>
<li>Gresham, D., Usaite, R., Germann, S. M., Lisby, M., Botstein, D., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+to+diverse+nitrogen-limited+environments+by+deletion+or+extrachromosomal+element+formation+of+the+GAP1+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18551-18556 (2010).</li>
<li>Windle, B., Draper, B. W., Yin, Y. X., O'Gorman, S., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+chromosome+breakage+in+gene+amplification%2C+deletion+formation%2C+and+amplicon+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">A central role for chromosome breakage in gene amplification, deletion formation, and amplicon integration.</a> Genes & development. 5 (2), 160-174 (1991).</li>
<li>Gresham, D., Ruderfer, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Detection+of+Polymorphisms+at+Nucleotide+Resolution+with+a+Single+DNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Detection of Polymorphisms at Nucleotide Resolution with a Single DNA Microarray.</a> Science. 311 (5769), 1932-1936 (2006).</li>
<li>Kidd, J. M., Cooper, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+sequencing+of+structural+variation+from+eight+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and sequencing of structural variation from eight human genomes.</a> Nature. 453 (7191), 56-64 (2008).</li>
<li>Gresham, D., Desai, M. M., Botstein, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Repertoire+and+Dynamics+of+Evolutionary+Adaptations+to+Controlled+Nutrient-Limited+Environments+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1-19 (2008).</li>
<li>Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Variation+and+the+Fate+of+Beneficial+Mutations+in+Asexual+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic Variation and the Fate of Beneficial Mutations in Asexual Populations.</a> Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).</li>
<li>van Loon, N., Miller, D., Murnane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+extrachromosomal+circular+DNA+in+HeLa+cells+by+nonhomologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Formation of extrachromosomal circular DNA in HeLa cells by nonhomologous recombination.</a> Nucleic Acids Research. 22 (13), 2447-2452 (1994).</li>
<li>Vinograd, J., Lebowitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+Topological+Properties+of+Circular+Dna%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physical and Topological Properties of Circular Dna.</a> Journal of General Physiology. 49 (6P2), 103(1966).</li>
<li>Shibata, Y., Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+MicroDNAs+and+Chromosomal+Microdeletions+in+Normal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal MicroDNAs and Chromosomal Microdeletions in Normal Tissues.</a> Science. 336 (6077), 82-86 (2012).</li>
<li>Dillon, L. W., Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Extrachromosomal+MicroDNAs+Is+Linked+to+Mismatch+Repair+Pathways+and+Transcriptional+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Production of Extrachromosomal MicroDNAs Is Linked to Mismatch Repair Pathways and Transcriptional Activity.</a> Cell Reports. 11 (11), 1749-1759 (2015).</li>
<li>Li, L. L., Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metamobilomics+-+our+knowledge+on+the+pool+of+plasmid+encoded+traits+in+natural+environments+using+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+microbiology+and+infection+%3A+the+official+publication+of+the+European+Society+of+Clinical+Microbiology+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Metamobilomics - our knowledge on the pool of plasmid encoded traits in natural environments using high-throughput sequencing.</a> Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 18, 5-7 (2012).</li>
<li>Brown Kav, A., Sasson, G., Jami, E., Doron-Faigenboim, A., Benhar, I., Mizrahi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+bovine+rumen+plasmidome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Insights into the bovine rumen plasmidome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5452-5457 (2012).</li>
<li>Møller, H. D., Parsons, L., Jørgensen, T. S., Botstein, D., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+circular+DNA+is+common+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal circular DNA is common in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 201508825(2015).</li>
<li>Drubin, D. G., Miller, K. G., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Actin-Binding+Proteins+-+Evidence+for+a+Role+in+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Yeast Actin-Binding Proteins - Evidence for a Role in Morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 107 (6), 2551-2561 (1988).</li>
<li>Magdolen, V., Drubin, D. G., Mages, G., Bandlow, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+profilin+suppress+the+lethality+caused+by+overproduction+of+actin+in+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">High levels of profilin suppress the lethality caused by overproduction of actin in yeast cells.</a> FEBS letters. 316 (1), 41-47 (1993).</li>
<li>Sandrock, T. M., Brower, S. M., Toenjes, K. A., Adams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressor+analysis+of+fimbrin+%28Sac6p%29+overexpression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Suppressor analysis of fimbrin (Sac6p) overexpression in yeast.</a> Genetics. 151 (4), 1287-1297 (1999).</li>
<li>Blanco, L., Bernad, A., Lázaro, J. M., Martìn, G., Garmendia, C., Salas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+DNA+Synthesis+by+the+Phage+%C3%B829+DNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient DNA Synthesis by the Phage ø29 DNA Polymerase.</a> The Journal of biological chemistry. 264 (15), 8935-8940 (1989).</li>
<li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Amplification+of+Plasmid+and+Phage+DNA+Using+Phi29+DNA+Polymerase+and+Multiply-Primed+Rolling+Circle+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification.</a> Genome research. 11 (6), 1095-1099 (2001).</li>
<li>Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+cloning+using+%C3%B829+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-free cloning using ø29 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17332-17336 (2005).</li>
<li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy Team, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible%2C+reproducible%2C+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biology. 11 (8), 86(2010).</li>
<li>Giardine, B., Riemer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+A+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Galaxy: A platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome research. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357(2012).</li>
<li>Tsalik, E. L., Gartenberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curing+Saccharomyces+cerevisiae+of+the+2+micron+plasmid+by+targeted+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Curing Saccharomyces cerevisiae of the 2 micron plasmid by targeted DNA damage.</a> Yeast. 14 (9), Chichester, England 847-852 (1998).</li>
<li>Norman, A., Riber, L., Luo, W., Li, L. L., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Method+for+Including+Upper+Size+Range+Plasmids+in+Metamobilomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An Improved Method for Including Upper Size Range Plasmids in Metamobilomes.</a> PLoS ONE. 9 (8), e104405(2014).</li>
<li>Storlazzi, C. T., Lonoce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+as+double+minutes+or+homogeneously+staining+regions+in+solid+tumors%3A+Origin+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure.</a> Genome research. 20 (9), 1198-1206 (2010).</li>
<li>Von Hoff, D. D., Needham-VanDevanter, D. R., Yucel, J., Windle, B. E., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+human+MYC+localized+to+replicating+submicroscopic+circular+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amplified human MYC localized to replicating submicroscopic circular DNA molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (13), 4804-4808 (1988).</li>
<li>Raymond, E., Faivre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hydroxyurea+on+extrachromosomal+DNA+in+patients+with+advanced+ovarian+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of hydroxyurea on extrachromosomal DNA in patients with advanced ovarian carcinomas.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 7 (5), 1171-1180 (2001).</li>
<li>Shimizu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+Double+Minutes+and+Chromosomal+Homogeneously+Staining+Regions+as+Probes+for+Chromosome+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+genome+research%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal Double Minutes and Chromosomal Homogeneously Staining Regions as Probes for Chromosome Research.</a> Cytogenetic and genome research. 124 (3-4), 3-4 (2009).</li>
<li>Eckhardt, S. G., Dai, A., Davidson, K. K., Forseth, B. J., Wahl, G. M., Von Hoff, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+HL60+cells+by+the+reduction+of+extrachromosomally+amplified+c-myc%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in HL60 cells by the reduction of extrachromosomally amplified c-myc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6674-6678 (1994).</li>
<li>Vogt, N., Lefèvre, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+double-minute+chromosomes+bearing+amplified+copies+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of double-minute chromosomes bearing amplified copies of the epidermal growth factor receptor gene in gliomas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11368-11373 (2004).</li>
<li>Ahn, K., Gotay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+rate+of+disease-related+copy+number+variations+in+childhood+onset+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+psychiatry%22%5BJournal%5D)">High rate of disease-related copy number variations in childhood onset schizophrenia.</a> Molecular psychiatry. 19 (5), 568-572 (2013).</li>
<li>Girirajan, S., Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+increases+in+both+common+and+rare+copy+number+load+associated+with+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Global increases in both common and rare copy number load associated with autism.</a> Human molecular genetics. 22 (14), 2870-2880 (2013).</li>
<li>Vogt, N., Gibaud, A., Lemoine, F., de la Grange, P., Debatisse, M., Malfoy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplicon+rearrangements+during+the+extrachromosomal+and+intrachromosomal+amplification+process+in+a+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Amplicon rearrangements during the extrachromosomal and intrachromosomal amplification process in a glioma.</a> Nucleic Acids Research. , (2014).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Çember-Seq yöntem dizisi düzey çözünürlüğe sahip maya hücrelerinden eccDNA genom ölçekli algılanmasını sağlar. yöntemi, yoğun girdap veya pipetleme gerektirmez ve bir sonraki aşamada ekzonükleaz sindirimine yol açar eccDNA kırılma sınırlamak için yer çekimi ile sütun ayrımı kullanan etmez hafif eccDNA saflaştırılmasıdır. Yöntemin bu özellikler gen dizilerini içeren büyük eccDNAs tespit edilmesi için önemli olabilir. Çember-Sıra tam genlerin (Dataset 1) olmak üzere çok sayıda eccDNAs algıladı. Aynı zamanda 86-kb maya mitokondrial DNA tespit edildi. Böylece, bu protokol, büyük dairesel DNA elemanları saflaştırılmasını kolaylaştırır. minimumda DNA ekstraksiyon adım sayısını tutulması eccDNA kaybı riskini azaltır ve verimi en üst düzeye çıkarır. kontrol sonuçlarına göre, ani yüksek voltajlı plazmidler, daire-Dizi 2500 hücrelerinden tek dairesel DNA tespit edilmesi, son derece duyarlıdır. Ayrıca, bu tür 2P gibi bol endojen plazmidler kaldırma; plazmid veya mitokondriyal DNA önemli ölçüde hassasiyeti artırmak olabilir. Maya kültürlerinden 2P sertleştirilmesi 30 tarif edilmiştir. Seçenek olarak ise, 2μ ve mitokondriyal DNA ayrılması, SwaI gibi nadir kesici endonükleaz ile elde edilebilir. Ancak, restriksiyon enzim adım diğer ilgi eccDNAs hedef ve toplam eccDNA verimi sınırlayabilir. eccDNA tespiti için kritik adım uygun bir derinliğe kadar Lineer DNA (aşama 3) ve DNA dizi analizi (aşama 5) çıkarılması idi. Bir hücre popülasyonundan eccDNAs çoğunluğu kaydetmek için, derin sıralama 20 gerekli olabilir. dairesel DNA kavşak eşleştirilmiş uç vermesi beklenen diskordan o haritayı okur olarak eşleştirilmiş sonu sıralama, eccDNA tespiti bile daha fazla güven vermelidir. Bu farklılıklar dairesel DNA yapılarının keşif destek ve potansiyel ek eccDNA algılama filtre olarak kullanılabilir. Çember-Seq yöntem üç bağımsız S. kullanılarak doğrulandı cerevisiae CEN.PK popülasyonları. Tespit dizileri daha önce eccDNAs, endojen plazmidleri rapor ve katkılı plasmidlerin ve ayrıştırılması eccDNAs (Veri kümesi 1) yüzlerce dahildir. Bu bulgular S. önceki Çember-Seq veri setleri destek cerevisiae S288c 20. CEN.PK ve S288c popülasyonları yaygın birçok eccDNAs bulunması, bu noktalar, dairesel elemanlar (Şekil 4) biri için bir eğilime sahip olduğunu gösterir. Biz daha önce diğer gerilme geçmişlerindeki [GAP1 dairenin] kanıtı bulunmamıştır olsa [GAP1 daire], CEN.PK arka 8 azot sınırlı koşullar altında zenginleştirilmiş olduğunu göstermiştir. S288c ve CEN.PK hem CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 ve HXT6 HXT7 loci ile ilgili eccDNA bölgesinin bulunması, DNA daire haline için yatkınlık con olduğunu göstermektedirmaya suşları arasında görev yaptı. [HXT6 / 7 daire], [ASP3-1 daire], [COS111 daire] ve [CUP1-1 RSC30 daire] hücrelere veya eğer seçici avantaj kazandırmaz eğer onların varlığı sadece yüksek oranlarda bir etkisi olduğunu göstermiştir gerekmektedir DNA daireselleştiğini. Birlikte ele alındığında, sonuçlar daire-Seq kilobaz-boy eccDNAs tespit edilmesi için uygundur ve tam genleriyle eccDNAs belirlenmesi için avantaj olduğunu göstermektedir. Çember-Seq maya eccDNAs tüm genom ölçekli ekranlar sağlayan son derece hassas bir yöntemdir. Çember-Seq yöntem gen silme ve büyütmeleri üreten eccDNA rolünü aydınlatılması amacıyla yeni bir araştırma alanı açabilir. DNA, mimarisi ve yapısı, büyük ölçüde daha yüksek ökaryotlar ökaryotik mayadan korunmuş olduğu göz önüne alındığında, daire-Seq yöntem olup, prensip olarak, applicabl olmalıdırküçük değişiklikler ile, tüm ökaryotik hücrelerde e. Şu anda, bu yöntem megabaz büyüklüğünde eccDNAs arıtmak için özelliği henüz gösterilecek olmakla birlikte, herhangi bir sınırlama olması görünmemektedir. Buna ek olarak, bir haddeleme-çember amplifikasyonu metodu 31 kullanan ø29 DNA polimeraz, kullanımı eccDNA miktar daha zor hale küçük eccDNAs karşı bir önyargı oluşturur. Çember-Seq insan somatik hücrelerinden çift dakika dairesel DNA üzerinde çalışmalar için uygun hale tam genleri taşımak için yeterince büyük eccDNAs algılar. Proto-onkogenler bu elemanların 32-37 güçlendirilmiş zaman çift dakikada kansere katkıda bulunabilir. germ hücrelerinde eccDNAs Çalışmaları germline mutasyon oranlarını ölçmek ve hayvancılık, örneğin sperm kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Böylece, daire-Seq gen telif içeren hastalıkların yeni bir anlayış genetik varyasyon kopya sayısı varyasyonu şeklinde ortaya hangi oranda içgörüler verim ve kurşun potansiyeline sahipnumara varyasyonu 38-40.

Bu büyük hücre popülasyonunda tek bir DNA molekülü değişiklikleri tespit gerektirdiği için, erken ya da geçici kromozomal amplifikasyonu algılama zordur. Kromozom kopya sayısı varyasyonları (CNVs) genellikle varyasyonu 1,2 oluşturulan mekanizmanın delil olarak sadece son CNV yapısını bırakarak, onların kurulmasından sonra iyi tespit edilir. Algılama ve genomik düzenlenmeleri devam eden süreçleri aydınlatmak olabilir KNV oluşumunun erken dönemlerinde ekstrakromozomal dairesel DNA (eccDNA) geri kazanılması. Daha önce, eccDNA de novo buluş, elektron mikrograflar 3, metafaz kromozomlarda 4 veya iki boyutlu jel elektroforezi 5 Giemsa lekelemesi uygulanmıştır. Bu yöntemler, dairesel DNA sekansı ile ilgili çok az ya da hiç bir bilgi sağlar. Böyle Güney yerinde hybridizatio PCR 8, ters 6,7 veya floresan kurutma olarak hedeflenen tekniklern 9 yalnızca belirli eccDNA elemanları hakkında kanıt sağlar. Bu yöntemlerden hiçbiri, bir hücre popülasyonunda var olan tüm eccDNA türleri dizisini sağlar. Hücrelerin bir havuzda genomik ayrışmanın genom dizileme ve / veya fayans dizileri 10,11 ile karakterize edilebilir. Bilinen DNA arındırma yöntemleri ile silme veya amplifikasyon algılama genellikle mutasyona uğramış alel hücre popülasyonu 12,13 en azından% 0.1-1 temsil gerektirir. Asentrik eccDNAs dolayı sentromer olmaması ve çoğaltma DNA sentezinin muhtemel olmaması, bir hücre kültüründe daha geçici olması beklenmektedir. En eccDNAs tahminen düşük miktarlarda bulunan ve sekanslar, genom benzediği Böylece, alternatif bir DNA ekstraksiyon yöntemleri eccDNAs tespit etmek için gereklidir. Birkaç dairesel DNA saflaştırma teknikleri kromozomlar ve dairesel DNA arasındaki yapısal farklılıkları istismar. örneğin, yüksek hızlı ultracentrifug içinsezyum klorür gradyanlar tirme, insan HeLa kanser hücre hattı 14 350-3000 baz çifti (bp), büyük eccDNAs izole etmek için kullanılır. Ancak, yüksek hız sedimantasyon hızı 15 ve eccDNA verim değiştirerek, nick, süper dairesel DNA yapılarının omurgasını kırmak ya da olabilir. Dutta ve arkadaşları de novo fare dokularından ve tavuk kültürler ve insan hücreleri 16,17 dairesel DNA genom ölçekli tanımlama için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntem plazmid saflaştırma ve enzimatik reaksiyonların ve DNA ekstraksiyon birkaç tur izledi sakaroz Ultrasantrifügasyon tarafından homojenize dokudan çekirdeklerin çekilmesidir. Bunların protokolü öncelikle 200-400 bp&#39;lik eccDNAs, adı microDNAs tanımlar. Dutta ve arkadaşları da Saccharomyces cerevisiae gelen microDNAs saflaştırılması çalıştı, ancak bu maya türlerinin 16 microDNA kayıt koyamadık. Biz yeni bir yöntem için geliştirdiğimizÇember-Seq denilen maya eccDNA de novo tespiti. Bu yöntem bütün genleri taşımak için yeterince büyük ve 86 kilobaz (kb) mitokondriyal DNA (mtDNA) gibi büyük dairesel DNA molekülleri için genom ölçekli anketler sağlar. Yuvarlak-Seq yöntemi ökaryotik maya hücreleri için optimize edilmiş ve derin dizilemesi ile birlikte, iyi kurulmuş bir prokaryotik plazmid saflaştırma yöntemi 18,19 geliştirilmiştir. Çember-Seq yaklaşım, 1756 farklı eccDNAs, tüm 1&#39;den büyük kb kullanarak, on S&#39;den saptandı cerevisiae S288c 20 nüfustur. Bir boyut kesme bütün genleri taşımak için yeterince büyük olduğunu eccDNA odaklanmak için seçildi. Yuvarlak-Seq çok hassas olduğu; Bu hücreler 20 bin içinde tek eccDNA tespit edildi. Bu çalışmada, daire-Seq yalıtmak ve başka S. üç biyolojik çoğaltır 294 eccDNAs tanımlamak için kullanıldı cerevisiae maya cinsi, CEN.PK. Veri eccDNA yaygın bir genetik eleme olduğunu ortaya koymaktadırS. nt cerevisiae suşları.

<table><tbody><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD Difco</td><td>211677</td><td>Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Brilliant III SYBR Yeşil PCR Master Karışımı&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>600882</td><td>qPCR analizi için. Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Dekstroz (D-glikoz)</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.4</td><td>Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Yıkıcı Boncuklar, 0,5 mm</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-BG05</td><td>Plazma hücre zarlarını bozmak için cam boncuklar. Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Carl Roth</td><td>2218.2</td><td>DNA/RNA'yı tespit etmek için agaroz jel boyası.</td></tr><tr><td>GeneJet plazmid mini hazırlık kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0502</td><td>Bakterilerden plazmit saflaştırması. Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>NotI, FastDigest</td><td>Yaşam Teknolojileri -&nbsp; Thermo Fisher Scientific, ABD</td><td>FD0594</td><td>Endonükleaz. Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Plazmid Mini AX kiti&nbsp;</td><td>A & Bir Biyoteknoloji, Polonya</td><td>010-50</td><td>eccDNA'yı saflaştırmak için kullanılan Plazmid saflaştırma kiti. &nbsp;</td></tr><tr><td>Plazmid-Güvenli ATP'ye bağımlı DNaz kiti</td><td>Epicentre, ABD</td><td>E3105K</td><td>ATP'ye bağımlı eksonükleaz kiti. Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Propidyum iyodür&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>81845</td><td>Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>pUG6 plazmid</td><td>EUROSCARF, Almanya</td><td>P30114</td><td>Belirteç geni: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP.</td></tr><tr><td>QIAGEN genomik uç 100 / G & nbsp;</td><td>Qiagen, ABD</td><td>13343</td><td>Mayadan genomik DNA saflaştırması. Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>REPLI-g Mini Kit protokolü&nbsp;</td><td>Qiagen, ABD</td><td>150023</td><td>eccDNA'nın phi29 polimeraz tarafından amplifikasyonu.</td></tr><tr><td>Maya ekstraktı</td><td>BD Difco</td><td>210929</td><td>Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme)</td><td>Nordic BioSite, İsveç</td><td>Z1004-3</td><td>Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Dizi dosyalarına veri erişimi</td><td>Avrupa Nükleotid Arşivi&nbsp;</td><td></td><td>Saccharomyces cerevisiae CEN'den EccDNA veri seti. PK113-7D olarak adlandırılır. Çalışma katılım numarası PRJEB9684. 2. katılım numarası ERP010820'dir. Locus etiketi öneki BN2032'dir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Suşlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae CEN. PK113-7D</td><td></td><td></td><td>Genotip MATa MAL2-8c SUC2</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae maya delesyon kütüphane havuzu</td><td>EUROSCARF, Almanya</td><td></td><td>S288c BY4741 KanMX modülü tarafından parçalanan 4400 canlı tek gen delesyon mutantı havuzu. Genotipler MAT<güçlü>a</güçlü> his3&Delta; 1 leu2 ve Delta; 0 met15 ve Delta; 0 ura3 ve Delta; 0 genexxx::KanMX.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Spektrofotometre&nbsp;</td><td>NanoDrop 1000 Spektrofotometre, Thermo Fisher</td><td></td><td>DNA konsantrasyonunun ölçülmesi. Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu,</td><td>Nikon Optronics, Magnafire. Kırmızı uyarma floresan filtresi, 663-738 nm.</td><td></td><td>Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Robotik kütüphane oluşturma sistemi</td><td>Apollo 324, IntegenX Inc.</td><td></td><td>DNA kütüphanesi hazırlığı. Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Sıralama platformu</td><td>Illumina HiSeq 2000 platformu, Illumina Inc.</td><td></td><td>DNA dizilimi. Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Ultrasonikatör</td><td>Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tüpler</td><td></td><td>Alternatif ürün kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Methods</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% YPD media&nbsp;</td><td></td><td></td><td>10 g Dekstroz, 10 g Maya özütü, 20 g Bacto pepton karıştırın ve toplam 1000 ml hacme H2O ekleyin ve otoklavlayın.</td></tr><tr>Genomik DNA <td></td><td></td><td>üzerinde Circle-Seq testi</td><td>Genomik DNA, maya delesyon kütüphanesinin (Euroscarf) bir havuzundan saflaştırıldı (Qiagen). DNA konsantrasyonu nanodrop ve 30 & mikro ile ölçüldü; g genomik DNA iki mikro santrifüj tüpüne pipetlendi. Bir mikro santrifüj tüpüne 100 nanogram plazmid (pUG6) takviye edildi. DNA örnekleri, 1.1-1.3 ve 1.5-1.7 protokol adımları atlanarak Circle-Seq ile saflaştırıldı. Ayrıştırılan DNA konsantrasyonları nanodrop ile ölçüldü ve örnek GD ve GD+P'den elde edilen tüm DNA verimi 29 saatlik bir süre boyunca eksonükleaz ile muamele edildi. Phi29-amplifikasyon ve PCR analizi için %10'luk bir fraksiyon toplanırken, kalan DNA 72 saatlik eksonükleaz tedavisine tabi tutuldu. Örnekler, kromozomal belirteç olarak ACT1 geni kullanılarak PCR ile doğrusal DNA içeriği açısından analiz edildi. Eksonükleaz ile muamele edilen numunelerin her birinin% 5'lik bir kısmı, 16 saat boyunca phi29 DNA polimeraz (Qiagen) tarafından amplifiye edildi. Her numunede DNA varlığı, eşit miktarda (7 & mikro; l) 0.5 & mikro üzerindeki kuyularda; g / ml etidyum-bromür %0.9 agaroz jeli çalıştırıldıktan sonra jel elektroforezi.</td></tr><tr><td>Haritalama yazılımı</td><td>Bowtie2 hizalayıcı, John Hopkins Üniversitesi</td><td></td><td>Ultra hızlı kısa okuma hizalaması. Referans: 29.</td></tr><tr><td>Propidyum iyodür lekesi</td><td></td><td></td><td>Probidyum iyot lekeli DNA'nın görüntüleri, RFP kanalında (kırmızı uyarma floresan filtresi, 663-738 nm) 100x büyütmede (100x/1.30 yağ, Nikon) floresan mikroskobu ile aynı açıklama süresi (5 saniye) kullanılarak yakalandı.</td></tr><tr><td>İş akışı biyoinformatik sistem</td><td>Galaxy, Açık kaynak.</td><td></td><td>Veri yoğun biyomedikal araştırmalar için ücretsiz bir web tabanlı platform. Kaynaklar: 27-28.</td></tr></tbody></table>

Ökaryotik hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel dna genom arıtma

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

<html> Ekstrakromozomal dairesel DNA&#39;lar (eccDNAs) Saccharomyces cerevisiae&#39;de yaygın genetik elemanlar ve hem de diğer ökaryotlarda bildirilmektedir. EccDNAs çok hücreli organizmalarda somatik hücreler arasında ve tek hücreli ökaryotlar evrimi genetik varyasyon katkıda bulunur. eccDNA tespit edilmesi için hassas yöntemler bu elemanlar genom stabilite ve ne çevreye ve biyolojik faktörlerin ökaryotik hücrelerde bunların oluşumuna neden nasıl etkilediğini açıklık için ihtiyaç vardır. Bu video Çember-Seq denilen duyarlı eccDNA-arıtma yöntemi sunar. yöntem dairesel DNA, lineer kromozomal DNA, eccDNA haddeleme daire amplifikasyon, derin sıralama ve haritalama kalan çıkarılması sütun arıtma kapsar. Kapsamlı eksonükleaz tedavi yeterli doğrusal kromozomal DNA bozulması için gerekli oldu. tarafından yuvarlanma daire amplifikasyon adımine-height:. Normal; &quot;10 10 hücrelerinin üç S. cerevisiae CEN.PK popülasyonlar üzerinde Çember-Seq yönteminin&gt; doğrusal DNA üzerinde dairesel DNA için zenginleştirilmiş φ 29 polimeraz Doğrulama 1 kilobaz daha büyük boyutlarda eccDNA profilleri yüzlerce tespit . ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, S288c ve CEN.PK DNA daireselleştiğini bu odakta suşları arasında muhafaza edilir önerir hem de dairesel DNA HXT7 genler. Özetle tekrarlanan bulgular, Çember-Seq yöntem geniş vardır ökaryotlarda ve belirli eccDNA türlerini tespit etmek için eccDNA genom ölçekli tarama uygulaması.

Yuvarlak-Seq yöntemi üç S doğrulamak için Hücreler, on kuşaktır YPD ayrı büyütüldü sonra 1 10 x 10 hücre cerevisiae CEN.PK popülasyonları elenmiştir. Daha önce 20 (veriler gösterilmemiştir), tarif edildiği gibi kromozomal doğrusal DNA kaldırılması, bir qPCR ACT1 sinyalinin olmaması ile de teyit edilmiştir. Saflaştırılmış ve zenginleştirilmiş eccDNA 68 milyon kadar sıralandı okur (141 nükleotid tek uçlu okur) ve CEN.PK113-7D referans genom (sürüm 19 Haziran 2012) çizilmiştir. C1, C2 ve C4 adlı üç örnekten varsayılan eccDNAs kayıtları okur uzun 1 kb daha bitişik tarafından eşlenen genomik bölgelere ayrıldı. 10.000 Monte Carlo simülasyonları dayanarak, bitişik tarafından eşlenen her bölgenin önemi 1 kb tahmin edilmiştir daha uzun okur. Bu 79, 159 ve 56 bölge büyük olasılıkla eccDNA dizileri (p &lt;0.1, Dataset 1) olarak şerh edilmiştir itibaren. Kaydedilen contiguo sayısıUS&gt; 1 kb örnekler, bundan başka (Şekil 2) dizisi olsaydı daha eccDNA elemanları kaydedilmiş açardı sekansı derinliğinin bir fonksiyonu olarak artan okur. Beklendiği gibi, daire-Seq yöntem çeşitli kromozom XII 2μ plazmid gibi bilinen dairesel DNA elemanları, mitokondriyal DNA, ribozomal RNA gen bir dizi okuma ekstre edilmiş ve numuneler çivili üç iç kontrol plazmidler arasında pBR322, pUC19 ve pUG72 sadece kolon saflaştırılması (Şekil 3) önce. Video bitişik bir örnek kromozom IV HXT7 _ARS432_ HXT6 mahaline eşleştirilmiş okur göstermektedir. Daha önce, [HXT6 / 7 daire] On S288c popülasyonları (1 x 10 10 hücreleri her biri) ve dairesel bir DNA yapısında daire-DİZ ile tespit edilmiştir ters PCR analizi 20 ile teyit edilmiştir. [HXT6 / 7 ciDairesel], aynı zamanda, üç CEN.PK popülasyonu (Şekil 4A), her kaydedilmiştir. Ayrıca, CEN.PK arasında, kopya numuneler arasında yaygın eccDNA genlerin en S288c veri setleri (Şekil 4B) ile ilgili eccDNA genleri çakışan. dairesel DNA saflaştırma, 30 ug genomik DNA, iki numune, her biri için daire-Seq protokol özgüllük test etmek için, test edildi. Bir numune, daire-Seq protokol ile saflaştırıldı her iki numuneden 100 ng plazmid DNA ve eccDNA ile takviye edilmiştir. Sütun ayrılmasından sonra, ürün eldesi plazmid (GD) plazmid ile numune için 1.60,% (480 ng) (GD + P) olmayan bir örnek için% 1.27 oranında (380 ng) idi. Ekzonükleaz tedavisinin etkileri. 29 saat, ACT1 karşı PCR kullanılarak 72 saat sonra, doğrusal DNA içeriği açısından test edildi Resim örnekler (veriler gösterilmemiştir) Act1 amplifiye içeriyordu. Her bir eksonükleaz ile muamele edilmiş numunenin bir kısmı ayrıca bir olduø29 tarafından mplified polimeraz ve enzimatik reaksiyonların ürünleri propidyum iyodid lekeleme (Şekil 5A-C) ve agaroz jel elektroforezi (Şekil 5G) ile analiz edilmiştir. Ekzonükleaz tedavi sonrası örnekleri az propidyum iyodin-leke (Şekil 5A-B) göstermektedir. Ø29 - tek genomik DNA ile amplifiye numune, kontrol numunesininkinden (Şekil 5E) &#39;e benzer iplik benzeri yapılar (Şekil 5C) saptandı. Ø29 - eklenen plazmid vardı güçlendirilmiş numune plazmid kontrolü (Şekil 5F) benzeyen odakları (Şekil 5D) saptandı. görüntüleri ø29 polimeraz doğrusal DNA üzerinde dairesel DNA için zenginleştirilmiş belirtti. En doğrusal kromozomal DNA, 29 saat ekzonükleaz tedavisi (Şekil 5A-B, G) sonra numunelerden çıkarıldı. Ancak, geniş eksonükleaz 100&#39;den fazla saat tedavi ve kullanarak 100&#39;den fazla adet oldu<html> güçlendirilmiş numuneler yine 72 saat eksonükleaz tedavi (Şekil 5C-D) sonra iplik benzeri yapıların bir arka plan gösterdi - ø29 olarak, tüm kromozomal doğrusal DNA kaldırmak gerekiyordu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig1.jpg" /> . Kolon kromatografisi, çıkan fraksiyonunda doğrusal kromozomal DNA kalan 3) sindirim, 4) amplifikasyon 1) hücre kültürü, 2) saflaştırma ve eccDNA zenginleşmesine: Çember-Sıra yöntemin Şekil 1. Anahat protokolü 5 adım vardır ø29 DNA polimerazın ve yüksek oranda zenginleştirilmiş eccDNA 5) sıralama ve haritalama DNA S. okur cerevisiae referans genom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. bitişik dizi derinliğinin fonksiyonu olarak&gt; 1 kb okur. EccDNA 1 10 x 10 hücreleri (eşlenen okur milyon) sekansı derinliğinin bir fonksiyonu olarak artış. Gösterilen: haploid CEN.PK S. biyolojik kopyaların 10 10 hücre bölünmesi ile ayrılmış cerevisiae nüfuslar (C1, C2, C4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54239/54239fig3.jpg" /> Bilinen dairesel DNA elemanlarının Şekil 3. tespiti. (AB) CEN.PK Biyolojik plazmidler için yüzde okuma kapsama araziler (yoğunluğu okuyun) Dağılım C1, C2 ve C4 çoğaltır. Vardı Haritalı (A) endojen maya plazmid okur: 2P; [RDNA daire] (Kromozom XII ribozomal RNA genlerinin); ve mitokondriyal DNA (mitokondriyal DNA). (B) Benzersiz plazmidler kontrol eşleştirilmiş okur. Kontrol plazmidler kolon saflaştırılması önce numuneleri içine çivili edildi. Hücre başına Plazmid oranları: pBR322 (artı işaretleri) 1: 1, pUC19 (daireler) 1:50, ve pUG72 (üçgenler) 1: 2,500. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54239/54239fig4.jpg" /> CEN.PK ve S288c Şekil 4. Ortak eccDNA elemanları. (A) Venn şeması 476 arasında örtüşme görüntüleme Üç CEN.PK örnekleri (C1, C2, C4) 294 eccDNA elemanları genler. 16 ortak örtüşen eccDNA genleri / plazmidler (tüm gen isimleri Dataset 1 olan) açıklamalı. S1-S2, R1-R4: 10 S288c örnekleri putatif eccDNAs üzerinde kayıtlı tüm genlerin göre (B), üç CEN.PK örnekleri (C1, C2, C4) arasında varsayılan eccDNAs üzerinde kayıtlı tüm genlerin Venn diyagramı,Z1-Z4 (referans 20). genler / plasmidler ve 2 türü arka ve ya 3 ya da daha fazla deney düzeneğinde, en az üst üste farazi eccDNA bölgeleri 13 biyolojik çoğaltır (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3) &#39;da gösterilmiştir. Cı örnekleri, CEN.PK; R ve Z&#39;nin örnekleri, S288c BY4741; S örnekleri, S288c M3750. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54239/54239fig5.jpg" /> Şekil eksonükleaz sonra DNA örneklerinin 5. Görselleştirme ve ø 2 9 tedavisi. DNA (AF) Propidium iyodür boyama. Ölçek çubuğu, 10 mikron. (A, C ve E), genomik DNA ile numuneler (GD); (B ve D) GD artı plazmid (GD + P) ile örnekler. ( <str<html> 29 saat ekzonükleaz muameleden sonra&gt; AB) (ekzo 29 H) Ong; Ø29 polimeraz amplifikasyonu takiben 72 saat ekzonükleaz muameleden sonra (CD) (ekzo 72 saat + ø29). (E) e sonra Genomik DNA kontrolü: ø29 polimeraz büyütmesi; (F) plazmid kontrolü (5.5 kb) sonra 29 polimeraz amplifikasyonu; (G ø) agaroz jel elektroforezi. L, 1 kb belirteçleri;: Soldan P, EXO 29 saat sonra plazma kontrolü (5.5 kb); GD, EXO 29 saat sonra (A gibi örnek); GD + P, EXO 29 saat sonra (B olarak örnek); GD ve GD + P, EXO sonra 29 saat + ø29; GD ve GD + P, EXO sonra 72 saat + ø29 (CD gibi örnek). Tablo S1 görün Daha fazla ayrıntı için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> aset 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg &quot;/&gt; CEN.PK. DataSet 1. Potansiyel DNA daireselleştiğini bölgeleri <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/DATASET1-CENPK.xlsx">bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> Dizi verileri olan gösterilmektedir ve 348 bölgeleri için analiz eder. Sütunlar AD, eccDNA haritalama vardır. farazi eccDNA tespit edildiği, numune, bir (soldan ilk sütun); B, kromozom; CD, başlangıç ​​ve bitiş varsayılan eccDNAs koordinatları. EH, eccDNA içeriği. E, özerk bölgede (ARS) dizisi çoğaltılıyor; F, bölgede tam geni; G, bölgede bulunan bir genin bir parçası; H, gen BLASTN tanımlanan. IO, EccDNA kapsamı ve p-değerleri. Ben, bp içinde benzersiz açıklamalı dizisi ile en uzun bölge; J, tüm okuma sayısıdır eşlenen; K, tüm eşlenen kapsamı eşleştirilmiş bir milyon okur (FPKM) dan kb başına parçalarından okur; Monte Carlo simülasyonları tesadüfen oluşması ile karşılaştırıldığında varsayılan eccDNA L, p-değeri; un M, sayıiquely okur eşlenen; NO; K ve L sadece benzersiz eşlenen kullanma gibi (UFPKM) okur. Haritalama için parametreler okur ve 20 açıklandığı gibi Monte Carlo simülasyonları idi.

Bu makale, ekstrakromozomal dairesel DNA'yı (eccDNA) saflaştırmak için Circle-Seq adı verilen hassas bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, kolon saflaştırmayı, kalan doğrusal kromozomal DNA'nın çıkarılmasını, yuvarlanan daire amplifikasyonunu ve yüksek verimli dizilemeyi kapsar. Circle-Seq, ökaryotik eccDNA'nın genom ölçeğinde taranması ve genom kararsızlığı ve kopya sayısı varyasyonunun incelenmesi için geçerlidir.

Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Ökaryotik hücrelerden genom çapında ekstrakromozomal dairesel DNA saflaştırılması. Merhaba, ben Rasmus. Burada, dairesel DNA saflaştırma yönteminin genel taslağını sunacağım.İlk bölümde, maya hücreleri kültüre edilir ve hasat edilir. Ardından dairesel DNA, üç adımda saflaştırılır ve amplifiye edilir. İlk olarak, DNA halkalarının saflaştırıldığı ve zenginleştirildiği kolon ayrıştırma yöntemi ile işlem gerçekleştirilir.Ardından, kalan tüm lineer DNA'yı sindirmek için DNA'nın eksonükleaz ile işlenmesi ve son olarak phi-29 polimeraz kullanılarak DNA halkalarının amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu protokolün beşinci bölümünde, DNA halkaları dizilenir ve okumalar Saccharomyces cerevisiae referans genomuna eşlenir. Videonun sonunda, size bazı temsili sonuçlar göstereceğiz.Gelecekteki çalışmalara yönelik perspektifleri ve bu yöntemi kullanmanın avantajlarını tartışacağız. Birinci bölüm, hücre hasadı. Başlangıç kültürü, 30 °C'de ajitasyonla, yaklaşık 24 ila 48 saat sonra ulaşılan ve mililitre başına yaklaşık 200 milyon hücre olan maksimum yoğunluğa kadar büyütülür.Üremiş kültür bir Falcon tüpüne aktarılır ve üç dakika boyunca santrifüjle çöktürülür. Süpernatan uzaklaştırılır. Oluşan büyük pelet TE tamponu içerisinde vortekslenir ve santrifüjle yeniden çöktürülür.İkinci bölüm, kolon saflaştırma. Bu adımda, genomik bakteriyel DNA'dan yüksek düzeyde saflaştırılmış plazmitler elde etmeyi sağlayan, ticari olarak mevcut bir kolon saflaştırma kiti kullanıyoruz. Bu kit mayalarla kullanılmadan önce, hücre duvarının parçalanması gerekir.Bu işlem, yıkanmış hücre peleti kit içeriğindeki L-1 tamponunda yeniden süspanse edilerek gerçekleştirilir. Hücre süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır ve toplam hacmin üçte biri kadar cam boncuk eklenir. Örnek, maksimum hızda 10 dakika boyunca vortekslenir ve boncuklar dakikada 2,000 devir hızında 30 saniye boyunca santrifüj edilerek uzaklaştırılır.Süpernatan yeni bir tüpe aktarılır. Bu yöntemde, süpernatana üç farklı oranda yüksek derecede seyreltilmiş plazmitler ekliyoruz. Döngüye yüksek derecede seyreltilmiş plazmit dahil edilmesini öneriyoruz.Bunlar dahili referans kılavuzları olarak hizmet edebilir. Bunları DNA saflaştırma ve amplifikasyonunuzun kalite kontrolü için kullanabileceğiniz gibi, bu spike-in plazmidlerini kullanarak hücre başına düşen dairesel olmayan DNA'ların yarı kantitatif tahminini de yapabilirsiniz. Diğer dairesel DNA'ların sekans çözünürlüğünü etkileyecekleri için yalnızca yüksek düzeyde seyreltilmiş plazmidler eklenmelidir.Eklenmiş plazmitler içeren hücre süspansiyonu, kit içindeki L-2 çözeltisi ile işlenir ve kit protokolü takip edilir. Kolon yüklendikten sonra, kolon iki kez yıkanarak proteinler, lipidler ve kromozomal DNA uzaklaştırılır. Ekstrakromozomal dairesel DNA, elüat fraksiyonunda yüksek derecede zenginleşir.Üçüncü bölüm, lineer DNA sindirimi. Bu adımda, geri kalan lineer DNA'yı sindirmek için bir ekzonükleaz kullanıyoruz. ATP bağımlı bir ekzonükleaz, dairesel DNA'yı sindirmeden, özellikle lineer çift sarmallı ve tek sarmallı DNA'yı hedefler.Ekzonükleazın lineer DNA'ya olan özgüllüğü, 29 saatlik DNaz işleminin ardından jel elektroforezi ile doğrulanmıştır. Sonuçlar, kırmızı okla belirtildiği üzere plazmid DNA'nın korunurken genomik DNA'nın sindirildiğini göstermektedir. Maya, uzunlukları 1.500 kilobaza kadar ulaşan 16 kromozom içerir.Ekzonükleaz sindirimini kolaylaştırmak için, erişilebilir DNA uçlarının sayısını artırmak amacıyla nadir kesim yapan bir endonükleaz kullanılır. NotI bazlı restriksiyon enzimi kullanıldığında, her kromozom belirtildiği üzere yedi kezle kadar kesilir. Kolonla saflaştırılmış DNA, bir ısıtma bloğunda 37 °C'de gece boyunca NotI ile işleme tabi tutulur.NotI'nin ısı ile inaktivasyonunun ardından, kesilmiş DNA, üreticinin protokolüne uygun olarak 37 derecede ekzonükleazlar ile işleme tabi tutulur. Ekzonükleaz uygulamasının ardından, enzimler 70 derecede 30 dakika boyunca ısı ile inaktive edilir. Tüm lineer kromozomal DNA'nın ek ATP ve ekzonükleaz ile sindirilmesi birkaç gün sürebilir. Tüm lineer DNA'nın tamamen sindirildiğinden emin olmak için numuneler, ACTI gibi bir internal referans gen kullanılarak PCR veya qPCR yöntemleriyle analiz edilir.Dördüncü bölüm, DNA amplifikasyonu. Bu adımda, phi-29 polimeraz kullanarak dairesel DNA'yı zenginleştiriyor ve amplifiye ediyoruz. Reaksiyon, rastgele hekzamer oligonükleotidler ve phi-29 kullanılarak 30 °C'de gerçekleşir.Polimeraz, yüksek sadakata ve düzeltme (proofreading) aktivitesine sahiptir ve bu da tarafsız DNA amplifikasyonu sağlar. Her bir polimeraz, yuvarlanan halka replikasyonu (rolling circle replication) yoluyla 100 kilobaza kadar DNA sentezleyebilir. Polimeraz ayrıca oldukça prosessiftir ve DNA'yı 10⁹ kata kadar amplifiye edebilir.Beşinci bölüm, sekanslama. Yüksek verimli yeni nesil sekanslama platformu protokolü takip edilerek, DNA ortalama 300 baz çifti boyutuna gelecek şekilde sonikasyona tabi tutulur ve 141 nükleotid tek uçlu okumalar şeklinde sekanslanır. Sekans okumaları, Galaxy ücretsiz veri tabanı kullanılarak Saccharomyces cerevisiae referans genomuna haritalanır.Sekanslanan veriler Galaxy'ye yüklenir ve okumalar, kısmi okumaların haritalanmasına olanak tanıyan kısa okuma hizalayıcı Bowtie2 kullanılarak eşleştirilir. Altıncı bölüm, temsili sonuçlar. Sekanslama ve Saccharomyces cerevisiae referans genomuna haritalama işleminden sonra, okumalar Galaxy yazılımı içindeki genom tarayıcısında görselleştirilebilir.Dairesel kökenli DNA, örneğin ekranda belirtildiği gibi bir kilobazdan daha büyük tutarlı okumalar içeren bölgeler olarak sayılabilir. Kromozom dört üzerinde bir kilobazdan daha geniş tutarlı okumalar içeren bir bölge örneği, altı ve yedi numaralı heksoz taşıyıcı genlerin bulunduğu bölgedir. Bu yöntem bir maya hücresi popülasyonu üzerinde kullanıldığında, eşlenmiş okumalar sıklıkla bu lokusta bulunur ve okuma kapsamı, paralog heksoz taşıyıcı genler arasında bir DNA halkasının oluştuğunu açıkça göstermektedir.Heksoz taşıyıcı genler arasındaki yüksek sekans homolojisi nedeniyle, meşru olmayan homolog rekombinasyonun bu DNA'nın daireselleşmesine yol açtığını öne sürüyoruz. Dairesel DNA mutasyonu modeli, DNA onarım sürecinin kusurlu şekilde yürütüldüğü durumdur. Örneğin, tekrarlayan bir elementte çift zincir kırılması meydana gelirse, aynı kromatid üzerindeki homolog sekans, homolog rekombinasyon yoluyla DNA onarımı için kalıp olarak kullanılabilir.Rezeksiyon, zincir istilası, DNA sentezi ve tüm bağlantıların çözülmesinden sonra, genomdan bir DNA halkası oluşarak kromozom üzerinde bir DNA delesyonuna neden olabilir. DNA'nın ekzonükleazlar ve phi-29 polimeraz ile işlenmesinin etkileri, propidyum iyodür boyaması kullanılarak görselleştirilebilir. Genomik DNA'nın boyama kontrolleri soldaki görüntüde, plazmit DNA ise sağdaki görüntüde olduğu gibi görünür.400 nanogram genomik DNA'nın 29 saatlik eksonükleaz işleminden sonra, soldaki görüntüde belirtildiği üzere DNA'nın büyük bir kısmı sindirilmiştir. Bu sonuç, sağdaki jel görüntüsünde gösterildiği gibi jel elektroforezi ile doğrulanmıştır. 72 saatlik eksonükleaz işleminin ardından phi-29 polimeraz ile gerçekleştirilen DA sentezi sonucunda, halen milyonlarca DNA kopyası tespit edilebilmektedir.Benzer şekilde, 400 nanogram genomik DNA ve ek olarak 100 nanogram plazmit DNA'nın 29 saatlik eksonükleaz işleminden sonra, genomik DNA'nın büyük çoğunluğu sindirilmiştir. Ancak, jel görüntüsünde belirtildiği üzere, plazmit DNA sindirilmemiştir. 72 saatlik eksonükleaz işlemine tabi tutulmuş örneğe phi-29 polimeraz işlemi uygulandıktan sonra, amplifiye edilen DNA'nın büyük çoğunluğu boyanmış plazmitler olarak görünmektedir.Öncelikle dairesel DNA için genleri taradık ve birkaç yüz farklı DNA örneği türü bulduğumuzda gerçekten çok şaşırdık. Evet, maya popülasyonunda DNA halkalarının ne kadar yaygın olduğunu görmek gerçekten şaşırtıcıydı ve bu yöntemin birçok çalışma türü için kullanılabileceğine inanıyoruz. Açıkçası, bunlardan biri insan dokusunu incelemek olacaktır.Genlerin asirküler elementler üzerinde ve elbette mayalarda, hatta tümör hücrelerinde amplifiye edilebildiğini biliyoruz. Genel olarak, somatik hücreleri incelemenin ve orada ne tür dairesel DNA'lar bulacağımızı ve bu daireselleşme etkisinin nasıl gerçekleşebileceğini araştırmanın ilgi çekici olacağını düşünüyorum. Yaşlanan hücrelerde, yaşlandıkça biriken halkalar mevcuttur ve dairesel DNA üzerinde daha fazla gen bulunmasını bekleriz.Buna ek olarak, DNA halkalaşmasının moleküler mekanizmalarını incelemek istiyoruz ve bunu yapmanın en belirgin yolu, homolog rekombinasyon ve ardından homolog olmayan rekombinasyon açısından defektif mutantlara sahip olduğumuz mayaları incelemektir. Bu mutantları çalışırken, DNA halkalaşma profilinin farklı mutant tiplerine göre farklılık göstermesini bekliyoruz ve umuyoruz ki maya çalışmaları sayesinde DNA halkalaşması hakkında çok daha fazla bilgi edinebileceğiz. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem çok daha hassastır. Aslında, yaklaşık her 10.000 hücreden birinde DNA halkasını bulabilmemiz mümkün olabilir.Ve oldukça kapsamlı şekilde yürütülen deneme çalışmalarından bildiğim kadarıyla, mutant alellerin tespit edilebilmeleri için normalde popülasyonun %1 ila %10'luk bir oranına ulaşmaları gerekir. Doğru, ve bu teknik sayesinde, diğer tekniklerin aksine, oluşan DNA halkaları hakkında önceden bilgi sahibi olmanız gerekmiyor; ya da DNA halkalarının bir miktar bağlanmış olması gerekir ve ardından bunları sekanslama veya kromozom boyama yoluyla amplifikasyonlar olarak kolayca tespit edebilirsiniz.Evet, sanırım asıl avantaj hassasiyet ve bu yöntemle birçok ilginç şey yapabileceğimizi umuyorum.

genome-wide-purification-extrachromosomal-circular-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Plazmid DNA Qiagen Miniprep Kit kullanarak Bakteri kolonileri Arındırıcı

Biz sezyum klorür yoğunluk gradiyenti santrifüj arıtma için 0.22 mikron Sterivex filtreler, konsantre planktonik biyokütle yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA çıkarılması için bir metodu tanımlar.

0.22 mcM Sterivex Filtreler ve Sezyum Klorür Yoğunluk Gradient Santrifüj DNA Ekstraksiyon

Mikrobiyal topluluk yüksek molekül ağırlıklı ve yüksek kalitede genomik DNA izole etmek için bir metodoloji tarif edilir.

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

Bu protokol, verimli paralel açıklama ve plazmid DNA arıtma için uygun maliyetli bir...

Prokaryotik Kültürler itibaren Plazmid DNA Aerodinamik Arıtma

Burada açıklanan, uzun okunan genom dizilemede kullanılmak üzere zorunlu biyotrofik mantar patojeni olan küllemeden genomik DNA'nın ekstraksiyonu, saflaştırılması ve kalite kontrolü için bir yöntemdir.

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

Hi-C 3.0, sinyal-gürültü oranını ve kromatin etkileşimi algılamasının çözünürlüğünü artırmak için formaldehit ve dissüksinimidil glutarat çapraz bağlayıcılarını DpnII ve DdeI kısıtlama enzimlerinin bir kokteyli ile birleştiren geliştirilmiş bir Hi-C protokolüdür.

Uzunluk Ölçekleri Arasında Kromozom Konformasyonunu Yakalama

Bu protokol, tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae'den doğal kromatin bağlamında ilgilenilen tek kopyalı bir gen lokusunu saflaştırmak için bölgeye özgü rekombinasyona dayalı lokusa özgü bir kromatin izolasyon yöntemi sunar.

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Burada, düşük moleküler ağırlıklı hücre dışı DNA oranını artırarak çevresel antimikrobiyal direnci (AMR) değerlendirmek için basit bir teknik sunuyoruz. % 20 -% 30 PEG ve 1.2 M NaCl ile önceki tedavi, hem genomik hem de yatay olarak transfer edilen AMR genlerinin saptanmasına izin verir. Protokol, ek optimizasyon ile kitsiz bir sürece uygundur.

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu 

CRISPR gibi teknolojilerin önündeki önemli bir engel, hayati genleri bozabilecek hedef dışı olaylardır. 'Dizileme ile Bölünme Etkilerinin İn Vitro Raporlaması için Döngüselleştirme' (CIRCLE-seq), istenmeyen bölünme bölgelerini belirlemek için tasarlanmış bir tekniktir. Bu yöntem, CRISPR-Cas9'un genom çapındaki aktivitesini yüksek hassasiyetle ve önyargısız olarak haritalandırır.

Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde ekstrakromozomal dairesel DNA (eccDNA) izolasyonu ve genom çapında tespiti için Circle-Seq yöntemini. Bu hassas protokol, genom stabilitesi ve evrim çalışmalarında uygulanabilir.

Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

Daha fazla video keşfet