Name: Implementação de um sistema coerente Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) em Ti: Safira e OPO Laser Based Laser Standard Scanning Microscope (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Aprenda a implementar microscopia CARS para imagem de células vivas sem marcadores usando lasers Ti:safira e OPO. Esta técnica permite estudos em neurociência e biologia com alta seletividade química.

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Os autores querem agradecer ao Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, França) pelo empréstimo do osciloscópio rápido e agradecer o apoio financeiro da Montpellier RIO Imaging (MRI). O RH reconhece que a ANR concede à France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) e à France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) redes de infraestrutura para desenvolvimentos coerentes de imagens Raman. Este trabalho foi apoiado principalmente por uma bolsa do Conselho Europeu de Pesquisa (FP7-IDEAS-ERC 311610) e uma bolsa INSERM - AVENIR para NT.

<ol><li>Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValeur%2C+B+%22Molecular+Fluorescence%3A+Principles+and+Applications%22">Molecular Fluorescence: Principles and Applications</a>. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+imaging+by+second-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JOSA+B%22%5BJournal%5D)">Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy.</a> JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).</li>
<li>Yelin, D., Silberberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+scanning+third-harmonic-generation+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology.</a> Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+Second-Harmonic+Generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li>
<li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).</li>
<li>Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).</li>
<li>Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+imaging+and+scoring+of+collagen+in+fibrotic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues.</a> Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+Instrumentation%2C+theory%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications.</a> J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).</li>
<li>Volkmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+and+microspectroscopies+based+on+coherent+anti-Stokes+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+D%3A+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy.</a> J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).</li>
<li>Evans, C. L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+chemical+imaging+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).</li>
<li>Mukamel, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMukamel%2C+S+%22Principles+of+nonlinear+optical+spectroscopy%22">Principles of nonlinear optical spectroscopy</a>. , Oxford University Press. New York. (1995).</li>
<li>Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope.</a> Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).</li>
<li>Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vibrational+imaging+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering.</a> Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).</li>
<li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+%28CARS%29+and+Stimulated+Raman+Scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li>
<li>Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipid+metabolism+in+live+Caenorhabditis+elegans+using+fingerprint+vibrations%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).</li>
<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+and+applications+to+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology.</a> Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).</li>
<li>Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diffusion+in+the+human+nail+measured+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).</li>
<li>Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+molecular+cutaneous+absorption+in+human+skin+using+label+free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy.</a> J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).</li>
<li>Kano, H., Hamaguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-nonlinear+optical+imaging+of+a+living+cell+using+a+supercontinuum+light+source+generated+from+a+photonic+crystal+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber.</a> Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).</li>
<li>Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+parametric+oscillator-based+light+source+for+coherent+Raman+scattering+microscopy%3A+practical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview.</a> J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106(2011).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimodal+platform+for+nonlinear+optical+microscopy+and+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy.</a> Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).</li>
<li>Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+Photonics+Rev%22%5BJournal%5D)">Multimodal nonlinear optical microscopy.</a> Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).</li>
<li>Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multimodal+nonlinear+optical+microscopy+reveals+fundamental+insights+of+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development.</a> Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).</li>
<li>Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+molecular+imaging+of+atherosclerotic+lesions+using+multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007(2007).</li>
<li>Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+disease+and+enlightening+biomedicine%3A+Raman+spectroscopy+as+a+diagnostic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool.</a> Analyst. 138, 3871-3884 (2013).</li>
<li>A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. , Germany. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator">http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator</a> (2015).</li>
<li>Ozçelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pals1+is+a+major+regulator+of+the+epithelial-like+polarization+and+the+extension+of+the+myelin+sheath+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves.</a> J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).</li>
<li>Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+saturated+and+unsaturated+lipids+by+wide-field+CARS-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy.</a> Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).</li>
<li>Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+spectra+measurement+of+olive+oil+and+other+vegetable+oils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils.</a> J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).</li>
<li>King, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy%3A+normal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Handb.+Clin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy: normal structure.</a> Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).</li>
<li>Monsma, P. C., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoroMyelin+Red+is+a+bright%2C+photostable+and+non-toxic+fluorescent+stain+for+live+imaging+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin.</a> J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).</li>
<li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).</li>
<li>Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chasing+lipids+in+health+and+diseases+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Vib.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).</li>
<li>Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal%2C+3D+in+vivo+imaging+of+sebaceous+glands+by+coherent+anti-stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+normal+function+and+response+to+cryotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy.</a> J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A parte mais desafiadora do trabalho é a sincronização temporal dos feixes de laser. Exige um fotodíodo rápido combinado com um osciloscópio rápido, mas apenas uma sobreposição áspera no tempo pode ser realizada em primeiro lugar. Em seguida, é necessário um novo ajustamento de alguns cm. Finalmente, micrômetro se move por uma fase de tradução linear permite realizar o ajuste fino do final do comprimento da linha de atraso para acionar o sinal de CARS. Este sinal é mantida numa gama estreita de cerca de 20 micrómetros, ...

A microscopia óptica tornou-se uma importante técnica para visualização não destrutiva de processos dinâmicos em sistemas biológicos vivendo com uma resolução subcelular. Microscopia de fluorescência é atualmente o contraste de imagem mais popular usado em células vivas, devido à sua alta especificidade e sensibilidade 1. Uma grande paleta de sondas fluorescentes (corantes emergiu exógenos, proteínas geneticamente codificados, nanopartículas de semicondutores). Várias técnicas fluorescente à base de iluminação da amostra floresceram (tal como microscopia confocal ou de dois fotões) realizar imagem 3D e para reduzir uma principal desvantagem desta técnica é que a fotodegradação 2. Outras limitações incluem a exigência de rotulagem fluoróforo porque a maioria das espécies moleculares não são intrinsecamente fluorescente e, portanto, essas fluoróforos tem que ser introduzido artificialmente na amostra trabalhada. Esta manipulação artificial pode ser prejudicial, especialmente para pequenas moléculas ou induz potcial foto-toxicidade. Estas razões fazem microscopia de fluorescência não adequado para observações in vivo em. Por isso, a utilização de técnicas de imagiologia óptica com alta sensibilidade e contrastes moleculares específicas, sem a utilização de moléculas fluorescentes é altamente desejável em ciências biomédicas. Várias técnicas de imagem óptica não linear, sem rotulagem ou coloração surgiram, incluindo segundo harmônico geração (SHG) 3,4 e geração de terceiro harmônico (THG) 5. Microscopia SHG foi usado para arranjos estruturais de imagem ao nível supramolecular microtúbulos tais como colagénio ou 6. THG é gerado a partir de heterogeneidades ópticas, tais como a interface entre o meio aquoso e lípidos 7. THG também foi demonstrada para a imagem de mielina 8,9. Ambas as técnicas podem ser aplicadas sobre um microscópio de fluorescência de dois fotões e requerem apenas um feixe de laser. No entanto, eles exigem intensidade do laser de alta potência (normalmente 50mW a 860 nm para SHG 10, 25 - 50 mW a 1180 nm para THG 9), que é deletério em amostras de vida, e não proporcionam a especificidade química que é necessária para inequivocamente imagem estruturas biológicas específicas. Quimicamente imagiologia selectivo pode ser obtido a partir de sinais de vibração molecular inerentes com base na dispersão de Raman. Quando um feixe de luz atinge matéria, fotões pode ser absorvida e dispersada pelos átomos ou moléculas. A maior parte dos fotões dispersos terão a mesma energia, ou seja, a frequência, tal como os fotões incidentes. Este processo é chamado de espalhamento Rayleigh. No entanto, um pequeno número de fótons serão espalhadas com uma frequência óptica diferente da frequência dos fótons incidentes, ou seja, com um processo de espalhamento inelástico chamado de espalhamento Raman. A diferença entre a energia provém de excitação de modos vibracionais, dependendo da estrutura molecular e do ambiente. Portanto, Raman espontâneo prov espalhamentoides imagiologia química selectiva como moléculas diferentes têm freqüências vibratórias específicas. No entanto, é limitada por causa de seu sinal extremamente fraco. A microscopia confocal Raman tem sido desenvolvido e fornece resolução espacial 3D, mas requer tempo de alta potência média e longa aquisição 11. Para superar essas dificuldades, avanços recentes na tecnologia laser têm permitido o aumento da microscopia óptica vibracional não-linear, em particular coerente dispersão anti-Stokes Raman (CARS) 11,12,13. CARS é um processo óptico não-linear de terceira ordem. Três feixes de laser, compostas por um feixe de bomba a ω frequência P, um feixe de Stokes na freqüência ω S e um feixe de sonda (na maioria das vezes sendo a bomba) estão focados em uma amostra e gerar um feixe de anti-Stokes na freqüência ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. O sinal anti-Stokes podem ser significativamente aumentada, quando a diferença de frequênciaentre a bomba eo Stokes vigas está sintonizado numa Raman molecular vibração Ω R = (ω P - ω S). sinal de CARS é baseado em múltiplos interação fóton. Ele gera, por conseguinte, um sinal coerente ordens de magnitude mais forte do que a dispersão de Raman espontânea. Microscopia CARS foi primeiro demonstrada experimentalmente por Duncan et al. 15. Zumbusch et al., Em seguida, melhorou a técnica, usando dois focados feixes de laser femtosegundo do infravermelho próximo com uma lente objetiva de alta abertura numérica, permitindo que a condição de casamento de fase de carros e evitando a dois fótons não-ressonante de fundo 16. CARROS microscopia, portanto, surgiu como uma ferramenta poderosa para imagens de células e tecidos ao vivo, através da detecção quimicamente moléculas como lipídios (através da vibração de estiramento CH) 17,18, água (através de vibrações de estiramento OH), proteínas, DNA em células vivas 19,20 mas também deuterado composto químicos para farmacêutico 21 e aplicações cosméticas 22. A principal limitação da microscopia não-linear origina a partir da complexidade e do custo das fontes ópticas. Um sistema CARS requer dois lasers ajustáveis ​​comprimento de onda com durações de pulso curto e com trens de pulso temporal e espacialmente sincronizados. Os carros adiantados microscópios foram baseadas em dois picosecond sincronizado Ti: lasers de safira 20. CARROS imagem também foi obtido a partir de um único Ti femtosecond: laser de safira gerando uma fonte de luz supercontínuo 23. Recentemente, fontes de laser compostas por um único Ti femtosegundo: laser de safira que bombeia um ópticos osciladores paramétricos sintonizável (OPO) têm sido utilizados para microscopia CARS. Esta configuração permite intrinsecamente temporalmente sincronizado vigas com uma diferença de frequência entre a bomba e o feixe de Stokes que cobre o espectro completo de vibração molecular 24. Além disso, microscópios de varredura de laser baseado num volume de negócioschave a laser fs e um OPO, usado principalmente para dois fótons de fluorescência (TPF) estão agora disponíveis para os não-físicos. O potencial de tais set-ups pode ser muito maior sem a necessidade de investimento adicional pela incorporação de outra imagem óptica não-linear, uma vez que cada modalidade de imagem não-linear (NLO) é sensível às estruturas ou moléculas específicas. Portanto Multimodal NLO imagem capitaliza o potencial da microscopia NLO para amostras biológicas complexas 25. O acoplamento destas técnicas permitiu a investigação de muitas perguntas biológicas, em particular sobre o metabolismo de lípidos, a pele ou o cancro de desenvolvimento 26, desenvolvimento muscular esquelética 27, 28 lesões ateroscleróticas. Além disso, a implementação de leitura por feixe de laser com CARS dá a capacidade de processamento de imagem de alta velocidade, ou seja, uma ferramenta atraente para estudar processos dinâmicos in vivo. O objetivo deste trabalho é mostrar cada passo para implementar ttécnica que ele CARROS em um microscópio padrão de varredura a laser multiphoton. O microscópio é baseado numa Ti FSEC: laser de safira e um OPO (bombeado pelo Ti: Safira laser) operado por um software para biólogos. A integração foi realizada por ajustamento do comprimento de um caminho do feixe de laser, a fim de sincronizar em tempo os dois feixes. Descrevemos a implementação passo-a-passo desta técnica que requer apenas conhecimentos básicos na óptica experimentais. Nós também ilustram CARS Imaging obtidas em bainhas de mielina do nervo ciático de roedores, e nós mostrar-lhe a imagem pode ser realizada simultaneamente com outra imagem óptica não-linear, como técnica de fluorescência de dois fotões padrão e segundo harmônico geração.

<table><tbody><tr><td>Osciloscópio</td><td>Tektronix</td><td>TDS 520D</td><td>500 MHz&nbsp;</td></tr><tr><td>Fotodetector</td><td>Thorlabs</td><td>DET08C/M, T4290</td><td>5 GHz InGaAs, 800 - 1.700 nm</td></tr><tr><td>Ti:Laser de safira Camaleão Ultra Família II</td><td>Oscilador</td> paramétrico óptico coerente <td></td><td></td></tr><tr><td>OPO Compact Family</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Examiner microscópio LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Periscópio motorizado</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetivo W Plan-Apochromat 20X/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Combinador de feixe</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modulador acústico-óptico</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atenuador de potência OPO</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomultiplicador</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandpass Filtros</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM BiG 1935-176</td><td>400 - 480 nm; 500 - 550&nbsp; Nm; 465 - 610&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Espelho dicróico</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Comprimento de onda de corte 760&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Silver espelhos</td><td>Newport</td><td>10D20ER.2&nbsp;</td><td>&lambda;/10, 480 - 20,000&nbsp; nm, Quantidade 4</td></tr><tr><td>Estágio de tradução de eixo único com micrômetro padrão</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>Quantidade 1</td></tr><tr><td>Placa de ensaio de alumínio</td><td>Thorlabs</td><td>MB1015/M&nbsp;</td><td>Quantidade 1</td></tr><tr><td>Montagem espelhada</td><td>Thorlabs</td><td>KMSS/M&nbsp;</td><td>Quantidade 4</td></tr><tr><td>Suporte de espelho para &Oslash; Óptica de 1"</td><td>Thorlabs</td><td>MH25</td><td>Quantidade 4</td></tr><tr><td>Diafragmas de Íris&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>ID8/M</td><td>Quantidade 3</td></tr><tr><td>Caixa protetora</td><td>Thorlabs</td><td>TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S</td><td>Quantidade 1</td></tr><tr><td>Postes ópticos</td><td>Thorlabs</td><td>TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M</td><td>Quantidade 8 (comprimentos dependendo da configuração)</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda 661 - 690 nm</td><td>Semrock</td><td>676/29 nm BrightLine&reg; filtro passa-banda de banda única</td><td>Quantidade 1</td></tr><tr><td>Esferas fluorescentes</td><td>ThermoFisher</td><td>TetraSpeck&trade; Kit de tamanho de microesferas fluorescentes</td> Cartão de visualização a laser Thorlabs Cartão de visualização a laser IR Vidro de segurança a laser Newport LV-F22.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> P5L07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FluoroMielina&trade; Mancha de Mielina Fluorescente Vermelha&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>F34652</td><td></td></tr></tbody></table>

implementação de um sistema coerente anti-stokes raman scattering (cars) em ti: safira e opo laser based laser standard scanning microscope

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

microscópios de varredura a laser, combinando a Ti femtosecond: laser de safira e uma óptica oscilador paramétrico (OPO) para duplicar a linha de laser tornaram-se disponíveis para os biólogos. Estes sistemas são projetados principalmente para a microscopia de fluorescência de dois fotões multi-canal. No entanto, sem qualquer modificação, microscopia óptica não-linear complementar, como segundo harmônico geração (SHG) ou terceira geração harmônica (THG) também pode ser realizada com este set-up, permitindo que imagens sem rótulo de moléculas estruturados ou médio aquosa interfaces de lípidos. Estas técnicas são bem adequados para a observação in vivo, mas estão limitados na especificidade química. Quimicamente imagiologia selectivo pode ser obtido a partir de sinais de vibração inerentes com base na dispersão de Raman. A microscopia confocal Raman fornece resolução espacial 3D, mas requer alta potência média e tempo de aquisição de comprimento. Para superar essas dificuldades, avanços recentes na tecnologia laser permitiram a develmento de microscopia óptica vibracional não-linear, em particular coerente anti Stokes-espalhamento Raman (CARS). CARROS microscopia, portanto, surgiu como uma ferramenta poderosa para imagens de células biológicas e ao vivo, por lipídios quimicamente mapeamento (através da vibração de estiramento CH), água (através de vibrações de estiramento OH), proteínas ou DNA. Neste trabalho, descrevemos a implementação da técnica CARROS em um microscópio multiphoton varredura a laser acoplado a OPO padrão. Baseia-se a sincronização em tempo das duas linhas de laser, ajustando o comprimento de um caminho do feixe de laser. Nós apresentamos uma implementação passo-a-passo desta técnica em um sistema multiphoton existente. A formação básica em óptica experimental é útil e o sistema apresentado não requer equipamento adicional caro. Também ilustram CARROS imaging obtidos em bainhas de mielina do nervo ciático de roedor, e mostra-se que esta imagem pode ser realizado simultaneamente com outra imagem óptica não linear, tal como o padrão two-photon técnica de fluorescência e geração de segundo harmônico.

<html> A frequência de trem de pulsos de Ti padrão: laser de safira é normalmente em torno de 80 MHz. A OPO tem a mesma frequência, uma vez que é bombeado pelo Ti: Safira laser. Por conseguinte, é necessário um osciloscópio de jejum de pelo menos 200 MHz. Um fotodíodo rápido na gama de 600 também é necessária a 1100 nm. A mudança temporais máxima ocorre quando o Ti: safira e os sinais OPO são deslocados de 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6,2 nanossegundos. Isso corresponde a um desvio má...

Coherent dispersão anti-Stokes Raman (CARS) Microscopia baseado em vibração inerente de títulos molécula permite imagens de células vivas quimicamente seletiva sem rótulo. Este trabalho apresenta a implementação de uma técnica de microscopia complementar sobre um microscópio de varredura a laser padrão multiphoton baseado em um Ti femtosecond: laser de safira e um laser OPO.

Implementação de um sistema coerente Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) em Ti: Safira e OPO Laser Based Laser Standard Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

O objetivo geral deste procedimento é implementar uma técnica complementar de microscopia chamada CARS, que permite imagem vital, seletiva quimicamente e sem marcação em um microscópio padrão de varredura a laser multiphoton baseado em um laser de titânio-safira de femtosegundo e um oscilador paramétrico óptico. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia ou neurociência, como o entendimento de doenças relacionadas a lipídios, mecanismos de penetração na pele ou distúrbios cutâneos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil de implementar em uma microscopia de varredura a laser padrão baseada em lasers Ti:Sapphire e OPO.O procedimento será demonstrado por Hassan Boukhaddaoui, pesquisador associado e chefe da plataforma de imagem do laboratório, e Vasyl Mytskaniuk. Ligue os lasers de titânio-safira e OPO conforme apresentado no protocolo textual. Ligue o computador do microscópio.Ligue os interruptores dos componentes do microscópio. Inicie o software clicando duas vezes no ícone na área de trabalho e configure-o de acordo com o protocolo descrito. Em seguida, coloque um espelho dicróico com comprimento de onda de corte em 760 nanômetros

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A combinação de três único comprimento de onda curto lasers pulsados ​​é usado para gerar espalhamento anti-Stokes Raman coerente (CARS) e CARS duplamente ressonante (DR-CARS). A diferença entre estes sinais fornece maior sensibilidade para a outra forma difíceis de detectar sinais Raman coerente, permitindo que imagens de fraca dispersores Raman.

Imagem diferencial de estruturas biológicas com Duplamente-ressonante Scattering Anti-Stokes Raman coerente (CARS)

Fonte: Espinoza, R., et al. Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores em tempo real do cérebro de camundongos para diagnóstico de tecidos. J. Vis. Exp. (2022).  O vídeo demonstra imagens de espalhamento Raman estimulado (SRS) de duas cores de seções de tecido cerebral de camundongos. Dois feixes de laser sincronizados são direcionados para a seção de tecido para excitar vibrações moleculares, resultando em uma mudança de intensidade relativa nos feixes. Lipídios e proteínas no...

Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores do tecido cerebral de camundongos

Neste manuscrito, é descrita a implementação de um microscópio de espalhamento Raman (SRS) estimulado, obtido pela integração de um conjunto experimental de SRS com um microscópio de varredura a laser. O microscópio de SRS é baseado em duas fontes do laser do femtossegundo (FS), em um ti-safira (ti: SA) e em oscilador paramétrico ótico sincronizado (OPO).

Implementação de um microscópio não-linear baseado em espalhamento Raman estimulado

Uma metodologia coerente de imagem de dispersão raman para visualizar e quantificar compostos farmacêuticos dentro da pele é descrita. Este artigo descreve a preparação do tecido da pele (humano e camundongo) e a aplicação da formulação tópica, aquisição de imagens para quantificar perfis de concentração esposteis e análises farmacocinéticas preliminares para avaliar a entrega de medicamentos tópicos.

Visualizando e quantificando compostos farmacêuticos dentro da pele usando imagens coerentes de dispersão de Raman

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite imagens livres de rótulos de biomoléculas com base em sua vibração intrínseca de ligações químicas específicas. Neste protocolo, a configuração instrumental de um microscópio de srs e fluorescência de dois fótons integrado é descrita para visualizar estruturas celulares na medula espinhal de camundongos vivos.

In vivo Imagem de tecidos biológicos com fluorescência combinada de dois fótons e microscopia de dispersão de Raman estimulada

A microscopia de dispersão raman estimulada (SRS) é uma técnica de imagem poderosa, não destrutiva e livre de rótulos. Uma aplicação emergente é a histologia raman estimulada, onde imagens de SRS de duas cores nas transições de proteína e lipídio de Raman são usadas para gerar imagens pseudo-hematoxilina e eosina. Aqui, demonstramos um protocolo para imagens de SRS em tempo real e duas cores para diagnóstico de tecido.

Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

A imagem eletrônica de dispersão de Raman (epr-SRS) de corantes Raman semelhantes ao arco-íris é uma nova plataforma para imagens de proteínas à base de epítope altamente multiplexadas. Aqui, apresentamos um guia prático, incluindo preparação de anticorpos, coloração de amostras de tecido, montagem de microscópio SRS e imagem de tecido epr-SRS.

Imagem de tecido altamente multiplexado com corantes raman

Este artigo apresenta a integração de um módulo de focalização espectral e um laser de pulso de dupla saída, permitindo imagens hiperespectrais rápidas de nanopartículas de ouro e células cancerígenas. Este trabalho tem como objetivo demonstrar os detalhes de técnicas ópticas não lineares multimodais em um microscópio de varredura a laser padrão.

Imagem Biomolecular da Captação Celular de Nanopartículas utilizando Microscopia Óptica Multimodal Não Linear

Este artigo compara diretamente os contrastes de resolução, sensibilidade e imagem da dispersão estimulada de Raman (SRS) e da dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) integrada à mesma plataforma de microscópio. Os resultados mostram que o CARS tem uma melhor resolução espacial, o SRS dá melhores contrastes e resolução espectral, e ambos os métodos têm sensibilidade semelhante.

Comparação direta da dispersão de Raman estimulada hiperespectral e microscopia de dispersão de Raman coerente para imagem química

Visualizar a mielinização é um objetivo importante para muitos pesquisadores que estudam o sistema nervoso. CARS é uma técnica compatível com a imunofluorescência que pode fotografar nativamente lipídios dentro do tecido, como o cérebro, iluminando estruturas especializadas, como a mielina.

Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

Aprenda a implementar microscopia CARS para imagem de células vivas sem marcadores usando lasers Ti:safira e OPO. Esta técnica permite estudos em neurociência e biologia com alta seletividade química.

Implementação de um sistema coerente Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) em Ti: Safira e OPO Laser Based Laser Standard Scanning Microscope (Vídeo) | JoVE Journal

Implementação de um sistema coerente Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) em Ti: Safira e OPO Laser Based Laser Standard Scanning Microscope

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