Visualizzazione del virus HIV-1 gag rilegatura a Giant unilamellari vescicole (GUV) Membrane

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare il legame del Gag dell'HIV-1 sulle membrane delle vescicole unilamellari giganti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del Bio Assembly. Come i ruoli creati dai lipidi con diverse catene osteo nel legame di membrana o nelle proteine virostrutturali, come le proteine Gag virali in vitro.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che il legame della membrana di Gag può essere rilevato visivamente sulle membrane delle vescicole unilamellari giganti. Subito dopo la miscelazione risulta potenzialmente deleterio, lunghe fasi di Post Miscelazione. La preparazione del bavaglio HIV-1 è trattata nel protocollo di testo e deve essere eseguita un giorno prima della preparazione dei GUV.

Estrarre le scorte lipidiche dal congelatore ed equilibrare a temperatura ambiente. Nel frattempo, impostare la temperatura del blocco termico ad almeno cinque gradi Celsius superiore alla temperatura di fusione più alta dei lipidi in uso. In questa dimostrazione, la temperatura è impostata a 65 gradi Celsius, la temperatura più alta che abbiamo usato.

I lipidi devono essere disciolti in solventi inorganici, conservati in fiale di vetro con tappi a vite rivestiti in teflon e avvolti in Parafilm. Una volta scongelato, assicurati che le sospensioni siano state eliminate. Calcolare i volumi lipidici necessari in base ai rapporti moldare/lipidico desiderati.

Quindi, aliquotare i volumi calcolati in una fiala di vetro pulita, con tappo a vite, utilizzando un dispositivo resistente al cloroformio, come una siringa di vetro di tipo Hamilton. Regolare il volume totale con un solvente organico appropriato, come il cloroformio. Quindi, preparare due nuovi vetrini rivestiti ITO per ogni camera di elettroformazione.

Verificare che il lato conduttivo della diapositiva sia rivolto verso l'alto controllando la resistenza utilizzando un multimetro, che dovrebbe essere di circa 200 ohm. Quindi, pulisci delicatamente le loro superfici utilizzando etanolo al 70% e salviette prive di lanugine. Quindi, pulire la superficie esterna dell'ago della siringa sciacquandolo con cloroformio e posizionare la siringa sul blocco termico.

Posizionare anche le guide rivestite di ITO pulite sul blocco termico, con il lato conduttivo rivolto verso l'alto. In pochi minuti, i vetrini raggiungeranno la temperatura. Quindi, aggiungere da 40 a 50 microlitri della miscela lipidica a uno dei vetrini.

Il lipide deve essere distribuito rapidamente, ma nel modo più uniforme possibile. Quindi, aggiungi un altro mezzo volume della miscela lipidica a un altro vetrino e stendilo immediatamente per creare un film lipidico uniforme. Sii veloce e delicato per evitare di danneggiare il sottile rivestimento ITO.

Se l'opacità della pellicola appare eccessivamente non uniforme, ripetere la procedura utilizzando una nuova diapositiva. Quindi, crea un secondo paio di vetrini per una miscela lipidica diversa come la prima. Uno strato uniforme di lipidi è necessario per una resa ottimale di GUV e l'uniformità compositiva dei GUV.

Conservare i vetrini in una camera di essiccazione sottovuoto per 60-90 minuti per rimuovere i livelli di tracce di solvente organico. Per il passaggio successivo, impostare un'incubatrice alla temperatura del blocco termico utilizzato nei passaggi precedenti e riscaldare una scorta di soluzione di saccarosio da 300 millimolari a quella temperatura. Inoltre, preparare una guarnizione PDMS strofinandola delicatamente con etanolo al 70% e lasciandola asciugare completamente.

Una volta che le diapositive si sono asciugate, posizionarle su una superficie pulita e premere delicatamente ma con decisione la guarnizione su una slitta in modo che la guarnizione formi una tenuta stagna. Verificare l'assenza di gas tra la guarnizione PDMS e la slitta. Quindi, riempire completamente la guarnizione con la soluzione di saccarosio preriscaldata.

Non lasciare bolle. Ora, premere l'altra slitta rivestita sopra la guarnizione allineata con l'altra slitta. Assicurarsi che non vi siano bolle e fissare la camera utilizzando le clip per legante.

Quindi, rimuovere la soluzione di saccarosio in eccesso mediante aspirazione e pulire i vetrini utilizzando salviette prive di lanugine. Per procedere, fissare il gruppo slitta a una barra di rame in modo tale che il lato conduttivo di ciascuna slitta sia a contatto uniforme con la barra. Quindi, collegare la barra di rame all'uscita del generatore di funzioni e posizionare il gruppo all'interno dell'incubatrice con il generatore di funzioni rimasto all'esterno.

Una volta raggiunta la temperatura, programmare il generatore di funzioni in modo che applichi un'onda sinusoidale di 10 Hz e una differenza di potenziale di un volt per 90 minuti. Assicurati che la tensione sia di un volt usando un multimetro. Dopo 90 minuti, diminuire lentamente la frequenza a due Hz e continuare l'elettroformazione per altri 10 minuti.

Durante questo periodo, prelevare l'HIV-1 Gag dalla reazione di traduzione in vitro impostata il giorno prima. Rimuovere gli aggregati indesiderati facendo girare i lisati e trasferire con cura il surnatante in un altro tubo. Dopo 10 minuti a due Hz, spegnere il generatore di funzioni, spegnere l'incubatrice e lasciare aperta la porta dell'incubatrice fino a quando l'armatura non torna a temperatura ambiente.

Una volta raffreddato, portare con cautela il gruppo vetrino sul banco e smontare delicatamente la camera rimuovendo il vetrino superiore con una pinza. Trasferire i GUV con un puntale per pipetta da 1000 microlitri agganciato in una nuova provetta. Maneggiare delicatamente questo tubo e utilizzare i GUV entro 90 minuti.

Quindi, preparare una camera di imaging. Attaccare un foglio PDMS contenente un piccolo foro su un vetrino coprioggetto pulito. Premerlo delicatamente e con decisione per una tenuta ermetica.

Quindi, mescolare cinque microlitri della reazione di traduzione in vitro con cinque microlitri di GUV. Dopo alcuni minuti, trasferire la miscela nella camera di imaging e procedere con l'imaging. Per evitare l'evaporazione, la camera di imaging può essere coperta con un vetrino coprioggetti.

Utilizzando il protocollo descritto, i GUV sono stati preparati composti da POPC, POPS e colesterolo in un rapporto molare da 4,7 a 2,3 a 3. La misurazione della florescenza dei segnali Gag YFP su un GUV mostra che non sono rilevabili sopra lo sfondo sulla superficie del GUV. Tuttavia, la proteina Gag-YFP si è legata in modo efficiente ai GUV quando il cervello-PIP2 è stato incluso nella miscela lipidica.

Il legame gag è evidente dall'aumento dell'intensità della florscenza sulla superficie della membrana, che, una volta scansionata, appare come un picco acuto. Una volta padroneggiata, a condizione che la proteina sia disponibile in una forma marcata in modo fluorescente, questa tecnica può essere eseguita in quattro o cinque potenze. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere delicati quando si maneggiano i GUV e di utilizzare sempre lipidi freschi quando possibile.

Questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo dell'assemblaggio dei retrovirus di esaminare le interazioni di membrana delle proteine Gag retrovirali in vitro senza lunghe procedure di Post Mixing, che possono alterare lo stato latente delle interazioni.